免疫组化技术要点

1. 固定

最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。

（1）BouinS固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。

（2）PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

2. 组织脱水、透明

时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

3. 切片时展片

有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

4. 烤片

60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

5. 蜡块及切片的保存

最好在4℃保存

6. 脱片问题

Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

7. 灭活内源性酶

（1）HRP系统：3%双氧水灭活

（2）AP系统：3%HAc灭活。

8. 暴露抗原

对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

9. 封闭

在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10. 抗体稀释

应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

11. 背景高

在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。

12. 返蓝

在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na₂HPO₄的饱和溶液返蓝。

13. 显色

一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

14. 在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。

15. 拍照

免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。