检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较
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研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。蛋白质—蛋白质互作网络是生物信息调控的主要实现方式,是决定细胞命运的关键因素。检测蛋白质间相互作用的实验方法有哪些?这些检测方法各有什么优缺点?总结如下。
共纯化、共沉淀,在不同基质上进行色谱层析(需要补充)蛋白质亲和色谱 基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过改基质时,可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。
以上两种方法都要共同的缺点:假阳性。实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的,并不是生理性的相互作用;蛋白的相互作用可能并不是直接的,可是由第三者作为中介的;有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。因此
实验结果还应经其他方法验证。
该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用,那么两者的结合将使金属膜表面的折射绿上升,从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料,安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门的等离子表面共振检测仪器。
使某处发生缺损,检测对其他地方的影响。
原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白,在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域和激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因。
缺点:自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性。
指两个荧光法色基团在足够近(<100埃)时,它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化,也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子的构象变化,能够定性定量的检测相互作用的强度。
缺点:此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合GFP给蛋白标记。