基于Cre/loxP系统建立的四环素诱导条件性基因敲除系统

基于 Cre/loxP 系统建立的四环素诱导条件性基因敲除系统

该系统包含两个互补系统，分别为tTA依赖和rtTA依赖的基因敲除系统，现在又被称为Tet―Off(tTA依赖)系统和Tet―On(rtTA依赖)系统。在这两个系统中，四环素控制转录因子tTA或rtTA与启动子Ptec的结合，从而调节下游基因的表达。所不同的是tTA与启动子Ptet的结合是不需要四环素的，四环素 阻碍两者之间的相互作用；而rtTA与启动子P1et的相互结合只有在四环素或者其衍生物多西环素(强力霉素)存在的情况下才会发生，没有四环素或者多西环素时两者不发生相互作用。因此这两个系统以相反的方式对四环素进行反应，成为两个互补系统。

该系统含有3个基本的要素：tTA或rtTA、Ptet、四环素或多西环素。其中tTA或rtTA作为一种转录因子是一个融合蛋白，具有两部分：一部分为来源于原核生物体内的四环素阻碍蛋白(Tet repressor，Tet R)；另一部分为来源于真核生物体内，是真核细胞内转录因子的转录激活结构域，应用最为广泛的是单纯疱疹病毒编码的VPl6的酸性结构域。这两部分构成的融合蛋白(tTA或rtTA)可以受四环素或者其衍生物的调节而发生构象变化，从而改变与相应的DNA序列(四环素抗性元件，Tet resistance operon，TetO)的结合能力。tTA或rtTA的另一个功能就是转录激活功能，当其在真核细胞内与相应的DNA反应元件结合后可以启动下游基因的转录。rtTA与tTA相比有几个氨基酸位置的突变，突变的结果是两者对四环素反应后产生的效应完全相反。rtTA只有在四环素存在的情况下才能与反应元件TetO相结合，而tTA只有在四环素不存在的情况下才能与TetO结合。在具体的应用中，tTA或rtTA被置于特定启动子的调控之下，以实现其在特定的组织器官中进行表达。

Ptet 是一个受tTA或rtTA调控的启动子，含有一个RNA聚合酶Ⅱ启动子的最小功能单位和若干个TetO序列，该启动子只有与tTA或rtTA结合时才能激活下游基因的表达。因此，在应用过程中Ptet 被用来调控Cre重组酶的产生。

四环素或多西环素作为Tet―On和Tet―Off系统的效应剂，与tTA或rtTA相互作用从而调节它们与Ptet 的亲和力。多西环素是四环素的衍生物，由于其具有毒性小、所用剂量小等优点，在实际应用中更为广泛。该系统发挥作用的机制如图所示。

Tet―on和Tet―off系统的作用机制

采用该系统进行条件性基因敲除时，要将受特异性启动子调控的tTA的表达载体转入小鼠体内，同时还要将受Ptet 启动子调控的Cre重组酶的表达载体也转入小鼠体内。这样一个转基因小鼠与loxP的转基因小鼠进行交配，产生的子代小鼠中会在特定组织和器官中表达tTA，tTA再与Ptet 结合后激活下游的Cre重组酶的表达，实现特定基因在特定组织器官中的敲除。如果在子代小鼠出生时就给予四环素，并且一直维持下去，特定基因的敲除就不会发生，只有在停止四环素的应用后才会发生该基因在特定部位的丢失。采用rtTA系统与上述情况正好相反，在不用四环素时基因敲除不发生，只有给予四环素时才会导致特定基因在特定部位的敲除。因此，该系统可以对靶位点的剔除或修饰进行时间和空间二维调控。