细菌总DNA的提取和鉴定

【目的和要求】

1.学会CTAB法提取细菌总DNA。

2.掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。

【实验原理】

DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定存在，若降低盐浓度，CTAB与核酸的复合物会沉淀出来，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。

DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于DNA分子或DNA片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。

【实验试剂和器材】

（一）试剂：

菌株（E.coli ）；蛋白酶K（20mg/ml）；琼脂糖；标准DNA水解液

1.10%SDS

2．酚/氯仿/异戊醇（1/1/1）

3.异丙醇；70%乙醇

4．LB培养基：蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g加蒸馏水至1升，然后灭菌备用。

5．TE缓冲液：10mM Tris• HCl,0.1mM EDTA (pH8.0)。

6． CTAB/NaCl溶液(5% w/v)：5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需要加热到65℃使之溶解，然后室温保存。

7．TAE缓冲液（50×）(pH8.0)：每升溶液中含有242g Tris,57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA。电泳时稀释成1× 浓度使用。

8．溴酚兰-甘油指示剂：先配制0.1%溴酚兰水溶液，然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成

9．0.5μg/ml 溴乙啶染液：称取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1xTAE缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5μg/ml。

（二）器材：

锥形瓶（250ml），1.5ml 离心管，水浴锅，离心机，电泳槽，电泳仪，摇床，移液枪，洁净工作台，电磁炉，紫外成像仪

【实验方法】

（一）细菌总DNA的提取

1.将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2.取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3.沉淀物加入567μl的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μl 10%SDS和15μl的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4.加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇，在洁净工作台中稍加干燥，重溶于20μl TE缓冲液(含RNaseA-25ng/ml)中，准备电泳检测。

（二）琼脂糖凝胶电泳

1.制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在室温放置0.5-1h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。

2.加样：取0.5-1μg 左右的样品，体积为10-20μl，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液，在同一凝胶板上进行电泳。

3.电泳：维持恒压100V，电泳0.5-1h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。

4.染色：

将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h。染液可反复多次使用。

5.观察：

将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。

【注意事项】

1.溴乙啶有毒，配制和使用溶液时要戴手套，勿将溶液滴洒在台面或地面上。溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。

2.倒凝胶板时不要太厚，否则影响电泳效果。