细菌总DNA的提取和鉴定实验

【目的和要求】

1. 学会CTAB法提取细菌总DNA。

2. 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。

【实验原理】

DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。CTAB(溴代十六烷基三甲胺)是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定存在，若降低盐浓度，CTAB与核酸的复合物会沉淀出来，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。

DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于DNA分子或DNA片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。

【实验试剂和器材】

(一)试剂：

菌株(E.coli );蛋白酶K(20 mg/ml);琼脂糖;标准DNA水解液

1. 10%SDS

2. 酚/氯仿/异戊醇(1/1/1)

3. 异丙醇;70%乙醇

4. LB培养基：蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 10 g加蒸馏水至1升，然后灭菌备用。

5. TE缓冲液：10 mM Tris HCl,0.1 mM EDTA (pH8.0)。

6. CTAB/NaCl溶液(5% w/v)：5 g CTAB 溶于100 ml 0.5 M NaCl溶液中，需要加热到65 ℃使之溶解，然后室温保存。

7. TAE缓冲液(50×)(pH8.0)：每升溶液中含有242 g Tris,57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA。电泳时稀释成1× 浓度使用。

8. 溴酚兰-甘油指示剂：先配制0.1%溴酚兰水溶液，然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成

9. 0.5 μg/ml 溴乙啶染液：称取5 mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10 ml,取1 ml此溶液用1xTAE缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5 μg/ml。

(二)器材：

锥形瓶(250 ml)，1.5 ml 离心管，水浴锅，离心机，电泳槽，电泳仪，摇床，移液枪，洁净工作台，电磁炉，紫外成像仪

【实验方法】

(一)细菌总DNA的提取

1. 将菌株接种于液体LB培养基，37 ℃震荡培养过夜。

2. 取1.5 ml培养物12000 rpm离心2min。

3. 沉淀物加入567 μl的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30 μl 10%SDS和15 μl的蛋白酶K，混匀，于37 ℃温育1 h.

4. 加入100 μl 5 mol/L NaCl,充分混匀，再加入80 μl CTAB/NaCl溶液，混匀后再65 ℃温育10 min。

5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5 min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6. 沉淀用1 ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇，在洁净工作台中稍加干燥，重溶于20 μl TE缓冲液(含RNaseA-25 ng/ml)中，准备电泳检测。

(二)琼脂糖凝胶电泳

1. 制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65 ℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在室温放置0.5-1 h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。

2. 加样：取0.5-1 μg 左右的样品，体积为10-20 μl，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液，在同一凝胶板上进行电泳。

3. 电泳：维持恒压100 V，电泳0.5-1 h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。

4. 染色：

将凝胶取出后浸入0.5 mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1 h。染液可反复多次使用。

5. 观察：

将凝胶板置于254 nm波长紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。

【注意事项】

1. 溴乙啶有毒，配制和使用溶液时要戴手套，勿将溶液滴洒在台面或地面上。溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。

2. 倒凝胶板时不要太厚，否则影响电泳效果。