真核细胞总RNA的提取与鉴定

【原理】

RNA的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节是必不可少的，也是最常使用的通过cDNA途径分析细胞基因表达的前提。

通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5μg RNA，但其中大部分为rRNA及由tRNA，而mRNA仅占1%～5%。虽然mRNA大小和序列各不相同，但在多数真核细胞mRNA的3’末端都带有一段较长的多腺苷酸链。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。

RNA分析其实是对组织细胞总RNA中的mRNA进行分析。最常用的方法主要有:原位杂交、RT-PCR、Northern ，另外还有: Sl 核酸酶作图分析、引物延伸法等。在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。

由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。

RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其他分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

一、防止RNA酶污染的措施

1．所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。

2．塑料器皿可用01%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。

3．有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。

4．配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经 滤膜过滤除菌。

5．操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6．设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶抑制剂

1．焦磷酸二乙酯 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的眯唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

2．异硫氰酸胍 目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

3．氧钒核糖核昔复合物由氧化钒离子和核昔形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4．RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin) 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

5．其他 SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

一、组织和细胞总RNA提取―异硫氰酸胍法

【操作】

1．样品处理

(1)培养细胞 收集细胞1～2×10⁷ ，离心，5000g×5min。对于贴壁培养细胞，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重悬细胞并转移至1Od离心管中；悬浮培养细胞可直接转移离心管；离心， 5000g×5mim PBS洗涤2次。弃上清，置冰浴。加预冷变性液2ml，充分摇动，使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。

(2) 组织 取1～2g组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置组织匀浆器中，加入预冷的变性液12ml，在冰浴中充分匀浆。

二、总RNA定量

RNA定量方法与DNA定量相似RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml 的单链RNA。

如用1cm光径，用双蒸水稀释RNA样品n倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度: RNA (mg/ml) = 40×OD260 读数×稀释倍数(n)/1000。RNA纯品的OD260 /OD280 的比值为2.0，故根据OD260 /OD280 的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解