血细胞的分离

血细胞由红细胞,白细胞,血小板等组成.实验中常用白细胞来做研究,如炎症渗出,细胞迁移,识别等都涉及到白细胞.白细胞又分为:粒细胞,淋巴细胞,单核细胞等.它们具有不同的功能.实验中常需要分离血细胞方能进行。

这里主要论述人外周白细胞的分离，主要是中性粒细胞（Neutrophil），淋巴细胞（Lymphocyte），单核细胞（Monocyte）的分离。其它骨髓，脾淋巴细胞等分离可参，不同种属间请注意分离液的选择。

细胞分离中需要注意的几个问题

1.如果您要做细胞培养，记住实验中所用的试剂（分离液，洗涤液等）、器械等都要是无菌消毒的，并注意实验中的无菌操作。

2. 离心转速单位及时间：目前国外的文献报道基本上用g为单位，注意g和转速（rpm）的换算。

3.离心温度：有的要求室温，有的要求4摄氏度。实验的操作要求尽可能熟练，连贯。

4.在用Ficoll分离单个核细胞（PBMC）时，通常含有少量的红细胞，对于一般的实验影响不大，如果实验要求较高，可采取裂解液（有的需要无菌），并注意裂解时间控制，以免影响单个核细胞的活性。

5. 在用Percoll配不连续梯度时（一般用高渗NaCl），注意各成份体积的准确性，否则密度与预期的不一样，影响分离效果。

6.用全血离心效果比全血稀释后再离心效果差，稀释一般等体积稀释一倍。

7.分离液与样本的体积比：一般应小于1：2（即一般为1体积分离液，2体积样本，不宜超过2体积，小于2体积均可）

8.洗涤液的成分：不同文献报道不一，有的使用PBS，有的为Hank’s，KRP等，可自己选定。主要是离子浓度及成份的不同，有的含有Mg2+,Ca2+。

9. 细胞活性：0.2%台盼蓝染色3－5分钟，镜下观察计数死亡细胞（蓝染）。

中性粒细胞分离的方法

1、 标准方法：Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法

1）  取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。

2）  吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Plasma, PPP）。

3）  余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。

4）  吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。

5）  沉淀的细胞用8mlPPP-生理盐水（1：4）重悬，并移到15ml离心管中。

6）  悬液细胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室温。

7）  吸取富含中性粒细胞和红细胞层，用0.155M　NH4Cl重悬细胞，使红细胞裂解，然后中性粒细胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，无钙）洗2次，最终用HBSA（含钙）重悬。

8）  用此法可得95%以上的中性粒细胞。

2、 不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法

1）  先制备Percoll储存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的体积比为9：1。

2）  取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。

3）  吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Plasma, PPP）。

4）  余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。

5）  吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。

6）  沉淀的细胞用2~3mlPPP重悬

7）  在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、2~3ml细胞悬液，275gX10min.

8）  单个核细胞及部分血小板位于血浆与42%Percoll液之间，中性粒细胞位于42%Percoll与51%Percoll之间。血小板可通过25%Percoll离心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三个25%Percoll一起离心去除。

9）  中性粒细胞层用PPP液冼1次，再用含糖的Krebs-Ringer磷酸缓冲液（KRPD，PH7.23）洗1次。

10）用这种方法可得80%中性粒细胞，纯度在95%以上。

3、“无LPS”方法（LPS-Free method)

1）已有用变形细胞（如白细胞）裂解的方法表明，容器及溶液的不含LPS，也就是说，LPS的含量小于0.1ng/ml。

2) 无菌采集静脉血，用10%柠檬酸钠抗凝。

3）抗凝血中加入6%的Dextran(mol wt 70,000)，比例为3：1（vol/vol,blood/dextran），室温，1小时。

4) 收集白细胞的血浆，离心，去上清。

5）红细胞用低渗的0.2%NaCl裂解15秒（此步也可用0.155M　NH4Cl　15秒代替）

6）离心前立即加入10ml 1.6%NaCl（含糖(dextrose) 2mg/ml）

7) 离心后用KRPD洗2次。

8）此法得到中性细胞数与方法2类似，但纯度只有80-85%，余下为淋巴细胞及单核细胞。

8）此法得到中性细胞数与方法2类似，但纯度只有80-85%，余下为淋巴细胞及单核细胞。

4　从3中所获得的中性粒细胞进行纯化

1）  因为方法3只能获得80－85%纯度的中性粒细胞，可以把方法2与方法3联合对中性粒细胞进行纯化。

2）  收集从方法3 dextran沉降所得到的富含白细胞的血浆，275undefined6min，离心。

3）  管底沉淀用2ml PPP重悬

4）  在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、2~3ml细胞悬液，275gX10min。

5）  分别用PPP及KRPD各洗1次

6）  用这种方法所得的中性粒细胞纯度高达99%以上，并且中间不需要红细胞裂解的步骤。

krebs-Ringer phosphate（KRPD缓冲液）的配制： 130 mM NaCl, 5mM KCl, 1.27 mM MgSO4, 0.95 mM CaCl2, 5 mM glucose, 10 mMNaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4

配制方法：

A液：NaCl　7.5985g ; KCl 0.3727g ; CaCl2 0.1054g，glucose-H2O 0.9495g, 加ddH2O 100ml溶解；

B液：NaH2PO4-2H2O 0.2964g Na2HPO4-12H2O 2.9011g，加100mlddH20溶解后加入MgSO4-7H2O　0.3130g，充分溶解。

将A、B混合，用ddH20将体积调节至990ml左右，用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4，定容至1000ml。

外周血中嗜碱性粒细胞分离方法（聚蔗糖－泛影葡胺法）

1）取肝素抗凝血3ml

2）加等量PH7.4HEPES-ACM缓冲液（HEPES 25ml含CaCl2 1ml,NaCl 130ml,KCL5mmol,MgCl2 1ml,用NaOH调节至PH7.4)混匀后，叠加在3ml的密度为1.085的分离液上，2000r/min离心20分钟；

3）吸取中间层的白细胞，用Hanks液洗2次，每次1000r/min离心10分钟，弃上清；

4）调整细胞浓度，涂片染色计数，嗜碱性粒细胞浓度大于90％。

外周血中嗜碱性粒细胞分离方法（Percoll密度梯度离心分离法）

1、Pcrcoll混悬液的配制：Percoll 90ml,HBSS 9ml, HEPES(0.25mol/l)1ml(PH 7.3),HCL(1mol/l)0.4ml 调节至PH7.4

2、制备Percoll密度梯度管

密度	Percoll/HBSS(ml/ml)
1.070	24:20
1.079	27:15.9
1.088	23:10

3、加分层液的顺序：底层先加4ml 1.088g/mlPercoll液，第二层加4Ml1.079g/mlPercoll液，嘴上曾加3ml 1.070g/ml的Percoll液，制成3个密度梯度管，用于分离碱性粒细胞。

4、将新鲜的抗凝血（用0.1mol/lEDTA PH 7.7抗凝）按等体积加于Percoll密度梯度分层液上，室温下1200r/min离心25分钟。

5、将每一细胞层分别吸出各放于1支试管内，加无Ca,Mg离子的Hanks液在4度下洗涤3次，每次1200r/min,离心10分钟弃去上清。

6、将分别得到的各层细胞涂片，固定后用Wright-Giemsa染液染色，在显微镜下检查嗜碱性粒细胞（大多数在中间层，但不同个体嗜碱性粒细胞的密度不同，因此可能会出现在其他细胞层），嗜碱性粒细胞染成紫红色。

外周淋巴血细胞分离（ficoll密度梯度离心法）

1.肝素抗凝静脉血，用Hank’s液约等体积或2倍体积稀释

2.用滴管轻轻加到FICOLL上，注意：动作要轻，缓，血液层和FICOLL层的界面要清晰。FICOLL和稀释后的血的体积比甚至可以达到1：4

3.离心:温度为25度，2000rpm 20分钟

4.离心后吸取中间的白色云雾状狭窄带（注意不要吸到FICOLL层），置于另一试管中

5.加入尽可能多的Hank’s液洗涤吸取的细胞，1600rpm 8分钟，洗2次

6.细胞计数，将细胞以一定的浓度种到培养板中，加入营养液培养。

7.分离的时候特别要注意温度，FICOLL和Hank’s液以及营养液使用之前要37度温一下；血液层和FICOLL层的界面清晰；FICOLL离心温度为25度，不能使用离心机上的brake功能。

外周淋巴细胞分离方法

1.5ml 抗凝血缓慢沿壁加到5ml淋巴细胞分离液上。（我用的是15ml离心管。有一次用50ml离心管，同样是5ml血对5ml分离液，就没分开，可能是淋巴细胞分离液的高度不够。如果血开始保存在4度，记得要回温到室温才开始添加）

2.室温 500g离心20分钟（好像离心时间不能过长，否则对细胞不好）

3.取中间云雾状白色杂带，置于另一50ml离心管中。

4.25ml PBS洗涤（如果混有红细胞，在之前可以用红细胞裂解液，37度裂解5分钟。）

5.1,000 rmp 离心10分钟

6.重复4和5

7.2ml 10% 胎牛血清+RPMI1640重悬。

8.计数

9.调整至10ml后培养。
如果要冻存，用冻存液（10%DMSO+20% 胎牛血清+RPMI1640）4℃,1-2h→-20℃,0.5h（这一步时间不能过长，否则冰晶过大，对细胞有害）→-80℃过夜 ，然后液氮中保存。如果，有那种能一度一度降温的盒子，冻存就好办了。直接按照它的说明做就行了。

单核细胞分离方法

将用等体积生理盐水稀释的抗凝血，加入塑料离心管中的Ficoll Hypaque分离液表面，以450 g离心25min收集单个核细胞，用10 小牛血清的RPMI一1640培养液悬浮细胞，置于6x 6 cm 玻璃培养皿中，在5 ％CO2 、37℃ 下孵育2 h，收集贴壁的单核细胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1 640培养液悬浮单核细胞，Wright染色计数单核细胞>95％，调整细胞密度为4×10／ml。将细胞悬液加入24孔培养板中，在5 ％CO2，37℃ 下培养24 h，离心收集上清液，冻存于一70℃ 冰箱中备用。细胞培养前后台盼蓝染色法测定细胞存活率。

单个血小板的分离和保存

无菌操作下穿刺肘中静脉取血，取用2% EDTA (1∶9)抗凝新鲜血,经100 ×g离心10 min, 获得富血小板血浆( PRP) , 经含1 g/L 牛血清白蛋白(BSA ) 的Hepes Tyrodes洗脱液平衡的Sepharose 2B凝胶柱分离纯化后得血小板沉淀,然后用TEN缓冲液(0. 05mol/L Tris2HCl, 0. 15 mol/L NaCl, 6 mmol/L ED2TA, pH 7. 4)洗涤3次,最后血小板悬浮于TEN缓冲液中,调血小板密度为1 ×109 /ml,加入终浓度为1 mmol/L 苯甲基磺酰氟( PMSF)和1%的Triton X2100,置于4 ℃冰箱过夜,次日10 000 ×g 离心15min,取上清液为血小板破碎液,分装, - 20 ℃保存备用。细胞培养前后用台盼蓝染色法测定细胞存活率 。