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SSR标记实验步骤

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18130

一、简介:

SSR简单序列重复标记(Simple sequence repeat, 简称SSR标记),也叫微卫星序列重复,是由一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列,长度较短,广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同,造成了SSR长度的高度变异性,由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同,但是其两端序列多是保守的单拷贝序列,因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物,通过PCR技术,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。

优点:

(1)标记数量丰富,具有较多的等位变异,广泛分布于各条染色体上;

(2)是共显性标记,呈孟德尔遗传;

(3)技术重复性好,易于操作,结果可靠。

缺点:

开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息,而且引物合成费用较高。

二、操作程序:

取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记。

1、DNA提取

按照Doyle和Dickson(1987)CTAB法(`Cetyl triethyl ammonium bromide)并略加改进的程序进行,具体步骤如下:

① 成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状,转入1.5ml离心管中,-20℃冰箱保存;

② 加入600μl 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30-60分钟;

③ 取出,冷却,上下摇匀后,加入600微升24:1的氯仿异戊醇;

④ 12000转/分钟离心10分钟,取上清液于另一个1.5ml的离心管中;

⑤ 加异丙醇,12000转/分钟离心10分钟,倒掉上清液;

⑥ 干后用100%的洒精清洗,干后加适量TE。


2、PCR扩增

模板DNA的浓度大约25ng/μl,扩增反应体系为20μl。具体如下:

Sterile ddH2O        11μl

PCR Buffer              3μl

dNTP-mix                 0.5μl

Primer1                     1μl

Primer2                     1μl

Taq polymerase      0.5ul(2U/μl)

DNA                            3μl  

PCR扩增程序为:(2h30min)  

①  预变性:94℃,5分钟;

②  变  性:94℃,40秒;

③  退  火:55℃  40秒;

④  延  伸:72℃,1分钟;

⑤  循  环:从2到4共38个循环;

⑥  72℃下最后延伸5分钟;4℃ 5min,扩增产物置于4℃的冰箱保存。


3、扩增产物的电泳分离

制胶→灌胶→上样→电泳。

扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离,步骤如下:

①  准备电极液(1×TBE);

②  将梳子拨出,并迅速用电极液冲洗胶面;

③  不预电泳;

④  点样,电泳220V;

⑤  拆板,并及时将内板、边条及梳子洗净。

4、凝胶染色

①  固定:10%醋酸,5分钟;

②  染色:10分钟;

③  漂洗:dH2O,5-10秒;

④  显色:甲醛-NaOH,直到满意为止;

⑤  漂洗:dH2O,2分钟。

 5、自封带封胶,读带标记,数码照相摄像,室温风干。

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