免疫组织化学（HRP-DAB系统）

1. 溶液准备：

PBS （ pH7.4 ） :10mM Na₂HPO₄ ，1.8mM KH₂PO₄ ， 50mM NaCl ， 2.7mM KCl

封闭缓冲液：3%BSA-PBS

2. 程序：

1 ） 对石蜡切片进行脱蜡和水化：3×10min 二甲苯，5min 100%乙醇，5min 95%乙醇，5min 80%乙醇， 5min 70%乙醇，3×5min PBS。

2 ） 修复抗原，PBS洗涤三次，每次5min。

3 ） 室温下，将玻片在3%H2O2-甲醇溶液中浸泡15min封闭内源性过氧化物酶，然后用PBS洗涤三次，每次 5min。

4 ） 加入一抗（用3%BSA-PBS封闭液1:50稀释一抗），37℃湿盒孵育1h。

5 ） 加入Post-blocking室温湿盒孵育30min,然后用PBS洗涤三次，每次5min。

6 ） 加入稀释好的辣根过氧化物酶（HRP）标二抗，室温下湿盒孵育30min。

7 ） 用PBS洗涤玻片5次，每次5min。

8 ） 按照DAB试剂盒说明添加显色液，避光显色30s-5min。用蒸馏水终止显色反应。

9 ） 苏木精进行复染色3min,用蒸馏水冲洗。

10 ） 立即进行脱水和透明：1×5min 70%乙醇，1×5min 80%乙醇，1×5min 90%乙醇，1×5min100%乙醇，2×10min二甲苯。

11 ） 中性树胶封片。

3. 抗原修复方法：

① 柠檬酸钠法：

（a） 把玻片放在玻璃固定架上，再将架子放在盛有600ml的10mM柠檬酸钠（pH6.0）的容器中。

（b） 微波中高火6-8min。

（c） 室温冷却。

（d） 用PBS洗涤3次，每次5min。

② 蛋白酶K法：

（a） 配制新鲜溶液：

25μl 20mg/ml蛋白酶K

2.5ml 1MTris-HCl（pH8.0）

0.5ml 0.5M EDTA（pH8.0） 加水定容到50ml

（b） 37℃下，将玻片放在架子上孵育5min（蛋白酶K不要预热）。

（c） 用PBS洗涤3次，每次5min.

③ 尿素法：

（a） 把玻片放在玻璃固定架上，再将架子放在盛有600ml 的1M尿素（新鲜配制）的容器中。

（b） 微波10min,20min或者30min,每5min补充一次蒸发掉的水。

（c） 冷却30min到1h。

（d） 用蒸馏水洗涤4次，每次3min,再用PBS洗涤3min。