电泳迁移实验(EMSA)方法

1. 探针的标记：

（1） 如下设置探针标记的反应体系：

待标记探针 （1.75pmol/微升） 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3，000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10u/微升） 1微升
总体积 10微升

按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。

（2） 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。

（3） 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

（4） 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

（5） 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。

2. 探针的纯化：

通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：

（1） 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。

（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

（3） 在4℃，12, 000g-16, 000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

（4） 在4℃，12, 000g-16, 000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

（5） 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。

3. EMSA 胶的配制：

（1） 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。

（2） 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶（注意：使用29：1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大）。

TBE buffer （10X） 1毫升
重蒸水 16.2毫升
39：1 acrylamide/bisacrylamide （40%，w/v） 2毫升
80% 甘油 625微升
10% 过硫酸铵 （ammonium persulfate） 150微升
TEMED 10微升

（3） 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。