生物技术常用实验操作简单介绍

一、总RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；

3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

二、琼脂糖核酸电泳

1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；

2. 根据欲分离DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30 ml）；

3. 放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；

4. 室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；

5. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；

6. 在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；

7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；

8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；

9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。

琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp）

0.5% 1,000～30,000

0.7% 800～12,000

1.0% 500～10,000

1.2% 400～7,000

1.5% 200～3,000

2.0% 50～2,000

三、胶回收纯化DNA

1. 琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；

2. 按照每100mg加400μl的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；

3. 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm 离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；

4. 加500μl的wash buffer至柱中，8,000rpm 离心1分钟。弃管中的溶液；

5. 重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的wash buffer；

6. 将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。

7. 注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100μl液量加400μl的binding buffer,其余的步骤不变。

四、大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）

此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。

1.  取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；

2.  将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 μl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡；

3.  加入200 μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；

4.  加入150 μl预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟；

5.  在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；

6.  用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；

7.  小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；

8.  加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH2O溶解；

9.  用0.5μl的RNase 37℃温育5~10分钟；

10.  电泳鉴定。

五、感受态细胞的制备

1.  挑取适当菌株的E.coli 单菌落接种于2ml SOB培养液中，37℃摇床过夜。

2.  取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB中，18℃剧烈震荡，直到A600达到0.6。

3.  将培养物转移到50ml离心管中，4℃ 4,000rpm/min离心10min。同时在冰浴上配置TB溶液。

4.  弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。

5.  取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15ml TB（1/3体积的起始培养液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min离心10min。

6.  弃上清，沉淀重悬于4ml TB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。

7.  加入280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。

8.  将菌液分装于EP管中，-80℃或液氮冻存。

9.  取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O（阴性对照）和1μl纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

六、SOB的配制：

蛋白胨 20g

酵母提取物 5g

NaCl 0.58g

KCl 0.186g

100×Mg++溶液 10ml

溶解并加水定容至1L，121℃×20min高压蒸汽灭菌

100×Mg++溶液：

MgCl2﹒6H2O

MgSO4﹒7H2O

溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高压蒸汽灭菌

TB溶液的配制：

1M KCl 5ml

0.55M MnCl2 2ml

0.5M CaCl2 0.6ml

0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2ml

ddH2O 10.4ml

Total 20ml

注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理

0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：

称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。

七、转 化

1.  取100μl感受态细胞于冰浴上融化。

2.  加入1μl纯质粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。

3.  将菌液放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2 min。

4.  加入0.9ml SOC，于37℃恒温摇床上200rpm×1hr温育。

5.  将菌液4000rpm/min离心3min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜。

i.  注：新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。

ii.  当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8μl 1M IPTG和40μl 20mg/ml X-gal以进行蓝白斑筛选。