细胞培养中支原体污染的特点及检验

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。

支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中心有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中心无颗粒群 或中心束。

支原体代谢需固醇类物质，部分种类需要精氨酸、O₂或葡萄糖。每一种支原体都有自身特点，多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6-8.0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。

支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化稍微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。

为确定有无支原体污染可做如下检测：

1.相差显微境检测

将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。

2.荧光染色法

荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的 Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗，置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1-2min，向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

3.电镜检查

用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。

4.DNA分子条文检查或支原体培养等方法

检出率高，但方法较为复杂。

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。