DNA片断化检测

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩， 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂， 形成50~300kbp长的DNA大片段， 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段， 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder.如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

1. 大分子染色体DNA片段的测定

细胞凋亡的早期，染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为“爬行”.

因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可以按其分子量大小分开。

参考文献 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.（1993） Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

2. DNA Ladder 测定

方法：收获细胞（1′107）沉淀，细胞裂解液，13000rpm′5min, 收集上清，1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，2h，蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4°C过夜，14000rpm′15min，最后将沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer，1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。

结果：[图6]

参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

3. 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

方法：收集细胞，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定过夜，PBS洗涤，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min，PI（50mg/ml）染色，室温避光15min，FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

结果：[图7]

4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay （CLONTECH）

优点：敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。