基因克隆的四大要素(Four Elements for Gene Cloning)

一、受体细胞 ：

受体细胞的选择是否合适将关系到能否表达，特别是高效表达。

首先要注意不同的表达载体与受体细胞的关系，即原核表达载体适合原核细胞，真核载体则适合真核细胞，而农杆菌仅适用于植物细胞。即使大肠杆菌质粒，也应注意选择合适的菌种。例如，当用含有T7 噬菌体启动子的载体表达外源基因时，由于T7 启动子只能被其本身的RNA 聚合酶（T7 RNA 聚合酶）所识别，所以必须使用具有产生T7 RNA 聚合酶能力的受体菌，如：BL21（DE3）、JM109（DE3）。对于一些缺失β-D-半乳糖酶氨基端的受体菌，则适合用带lacZ△M15基因的质粒（如：pUC），以便实现β-D-半乳糖酶α互补，进行蓝白斑筛选。

1．选择受体细胞的一般原则：
①易于接纳外源DNA；
②无特异的内源核酸内切酶；
③载体复制、扩增不受阻；
④与载体有互补性。
根据不同的需求，还应考虑：
①表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因型是否匹配；
②遗传稳定性高，易于进行扩大培养；
③受体细胞内源蛋白水解酶基因确失或蛋白酶含量低，利于外源基因蛋白表达产物在细胞内积累；
④可使外源基因高效分泌表达；
⑤对动物细胞而言，所选用的受体细胞对培养的适应性强；如：可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。
⑥受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性；
⑦无致病性；
⑧具有好的翻译后加工机制等。

2．受体细胞的基因型：
由于野生型大肠杆菌的基因（指没有发生突变的基因）具有可塑性，为了满足基因工程中的各种研究或生产的需求，研究人员对它们的基因组进行了改造，使某些基因发生突变或缺失，而引起大肠杆菌的性状特征（表型）发生变化。通常用基因型（Genotype），或称为遗传标记，来描述基因的变异, 野生型加“＋”，突变型加“－”（但后者往往被省略），表示的方法的规则如下：
①根据基因产物或作用产物的英文名称，取其单词的第一字母，拼成三个字母并以斜体来表示。如：D NA A denine M ethylase, 即dam 。
②变异基因不同，但引起的结果相同，则用作用结果的英文名称的前三个字母斜体表示，并加上一大写字母，以示区别。如：Recombination , rec A、rec B、rec C。
③某个基因缺失时，在该基因型前加“△”。
④由于某个基因变异导致大肠杆菌的特征发生变化，也可以用该特征的英文名来表示，但第一个字母要大写，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上“-”则表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗性标记为amp r, 敏感性为amp- 。

二、实验过程中菌种的保存和鉴定的重要性

实验过程中，菌种的保存十分重要，特别是那些经过筛选得到的带有阳性质粒的菌株。筛选出来的阳性菌株经常需要转接，而转接过程一方面要防止污染，同时还要防止质粒的丢失。一个最常用的措施是利用抗生素抑制那些丢失质粒的变异菌落的生长，但实际在菌落生长过程中抗生素会失效，导致杂菌污染而影响质粒的收率或蛋白质的表达量。因此注意保存原始菌是非常重要的，必要时在转接前对保存菌进行画线，挑出好的单菌落进行转接，并再保存一份新的菌种。对这种常规操作不可掉以轻心，否则损失是难以弥补的。

参考文献：
1. 李俊明、朱道银、伊正君、江山、骆旭东,分枝杆菌融合表达ICL2GFP 穿梭质粒的构建及鉴定，第四军医大学学报，2005 ;26(1)：9-13
2. Slilaty SN，Lebel S.，Accurate insertional inactivation of lacZ alpha: construction of pTrueBlue and M13TrueBlue cloning vectors. Gene. 1998，213 (1-2)：83-91
3. 王汉中、黄七、司艳红等，一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统，中国病毒学，2002，17(4)：319～325
4. 洪华珠、彭建新，一株高水平表达重组蛋白昆虫细胞系的建立，昆虫学报，2001，44(3)：276～280
5．黄粤、刘德培、梁植权，细菌人工染色体( BAC)及其分析和修饰方法简介，生物化学与生物物理进展，2001，28(3)：309－313 ；
6．陈凡国、张学勇、夏光敏、贾继增，野生一粒小麦BAC 文库的构建和鉴定，植物学报，2002，44 (4)：451-456
7. 昝云红、孙茂盛、郭仁、代长柏，水蛭素变异体I 基因的合成及其在酵母中表达的初步研究，中国医学科学院学报，1998，20（5）：361－366
8. 黄亚东、苏志坚、郑青、赵文、许华、吴晓萍、胡晓辉、李校彷、刘丙萍，人转化生长因子TGF2β3 基因合成及其在大肠杆菌中的表达，中国药科大学学报，2003 ,34 (3) :264～267

四、受体细胞 ：

受体细胞的选择是否合适将关系到能否表达，特别是高效表达。

首先要注意不同的表达载体与受体细胞的关系，即原核表达载体适合原核细胞，真核载体则适合真核细胞，而农杆菌仅适用于植物细胞。即使大肠杆菌质粒，也应注意选择合适的菌种。例如，当用含有T7 噬菌体启动子的载体表达外源基因时，由于T7 启动子只能被其本身的RNA 聚合酶（T7 RNA 聚合酶）所识别，所以必须使用具有产生T7 RNA 聚合酶能力的受体菌，如：BL21（DE3）、JM109（DE3）。对于一些缺失β-D-半乳糖酶氨基端的受体菌，则适合用带lacZ△M15基因的质粒（如：pUC），以便实现β-D-半乳糖酶α互补，进行蓝白斑筛选。

1．选择受体细胞的一般原则：
①易于接纳外源DNA；
②无特异的内源核酸内切酶；
③载体复制、扩增不受阻；
④与载体有互补性。
根据不同的需求，还应考虑：
①表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因型是否匹配；
②遗传稳定性高，易于进行扩大培养；
③受体细胞内源蛋白水解酶基因确失或蛋白酶含量低，利于外源基因蛋白表达产物在细胞内积累；
④可使外源基因高效分泌表达；
⑤对动物细胞而言，所选用的受体细胞对培养的适应性强；如：可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。
⑥受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性；
⑦无致病性；
⑧具有好的翻译后加工机制等。

2．受体细胞的基因型：
由于野生型大肠杆菌的基因（指没有发生突变的基因）具有可塑性，为了满足基因工程中的各种研究或生产的需求，研究人员对它们的基因组进行了改造，使某些基因发生突变或缺失，而引起大肠杆菌的性状特征（表型）发生变化。通常用基因型（Genotype），或称为遗传标记，来描述基因的变异, 野生型加“＋”，突变型加“－”（但后者往往被省略），表示的方法的规则如下：
①根据基因产物或作用产物的英文名称，取其单词的第一字母，拼成三个字母并以斜体来表示。如：D NA A denine M ethylase, 即dam 。
②变异基因不同，但引起的结果相同，则用作用结果的英文名称的前三个字母斜体表示，并加上一大写字母，以示区别。如：Recombination , rec A、rec B、rec C。
③某个基因缺失时，在该基因型前加“△”。
④由于某个基因变异导致大肠杆菌的特征发生变化，也可以用该特征的英文名来表示，但第一个字母要大写，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上“-”则表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗性标记为amp r, 敏感性为amp- 。

五、实验过程中菌种的保存和鉴定的重要性

实验过程中，菌种的保存十分重要，特别是那些经过筛选得到的带有阳性质粒的菌株。筛选出来的阳性菌株经常需要转接，而转接过程一方面要防止污染，同时还要防止质粒的丢失。一个最常用的措施是利用抗生素抑制那些丢失质粒的变异菌落的生长，但实际在菌落生长过程中抗生素会失效，导致杂菌污染而影响质粒的收率或蛋白质的表达量。因此注意保存原始菌是非常重要的，必要时在转接前对保存菌进行画线，挑出好的单菌落进行转接，并再保存一份新的菌种。对这种常规操作不可掉以轻心，否则损失是难以弥补的。

参考文献：
1. 李俊明、朱道银、伊正君、江山、骆旭东,分枝杆菌融合表达ICL2GFP 穿梭质粒的构建及鉴定，第四军医大学学报，2005 ;26(1)：9-13
2. Slilaty SN，Lebel S.，Accurate insertional inactivation of lacZ alpha: construction of pTrueBlue and M13TrueBlue cloning vectors. Gene. 1998，213 (1-2)：83-91
3. 王汉中、黄七、司艳红等，一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统，中国病毒学，2002，17(4)：319～325
4. 洪华珠、彭建新，一株高水平表达重组蛋白昆虫细胞系的建立，昆虫学报，2001，44(3)：276～280
5．黄粤、刘德培、梁植权，细菌人工染色体( BAC)及其分析和修饰方法简介，生物化学与生物物理进展，2001，28(3)：309－313 ；
6．陈凡国、张学勇、夏光敏、贾继增，野生一粒小麦BAC 文库的构建和鉴定，植物学报，2002，44 (4)：451-456
7. 昝云红、孙茂盛、郭仁、代长柏，水蛭素变异体I 基因的合成及其在酵母中表达的初步研究，中国医学科学院学报，1998，20（5）：361－366
8. 黄亚东、苏志坚、郑青、赵文、许华、吴晓萍、胡晓辉、李校彷、刘丙萍，人转化生长因子TGF2β3 基因合成及其在大肠杆菌中的表达，中国药科大学学报，2003 ,34 (3) :264～267

四、受体细胞 ：

受体细胞的选择是否合适将关系到能否表达，特别是高效表达。

首先要注意不同的表达载体与受体细胞的关系，即原核表达载体适合原核细胞，真核载体则适合真核细胞，而农杆菌仅适用于植物细胞。即使大肠杆菌质粒，也应注意选择合适的菌种。例如，当用含有T7 噬菌体启动子的载体表达外源基因时，由于T7 启动子只能被其本身的RNA 聚合酶（T7 RNA 聚合酶）所识别，所以必须使用具有产生T7 RNA 聚合酶能力的受体菌，如：BL21（DE3）、JM109（DE3）。对于一些缺失β-D-半乳糖酶氨基端的受体菌，则适合用带lacZ△M15基因的质粒（如：pUC），以便实现β-D-半乳糖酶α互补，进行蓝白斑筛选。

1．选择受体细胞的一般原则：
①易于接纳外源DNA；
②无特异的内源核酸内切酶；
③载体复制、扩增不受阻；
④与载体有互补性。
根据不同的需求，还应考虑：
①表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因型是否匹配；
②遗传稳定性高，易于进行扩大培养；
③受体细胞内源蛋白水解酶基因确失或蛋白酶含量低，利于外源基因蛋白表达产物在细胞内积累；
④可使外源基因高效分泌表达；
⑤对动物细胞而言，所选用的受体细胞对培养的适应性强；如：可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。
⑥受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性；
⑦无致病性；
⑧具有好的翻译后加工机制等。

2．受体细胞的基因型：
由于野生型大肠杆菌的基因（指没有发生突变的基因）具有可塑性，为了满足基因工程中的各种研究或生产的需求，研究人员对它们的基因组进行了改造，使某些基因发生突变或缺失，而引起大肠杆菌的性状特征（表型）发生变化。通常用基因型（Genotype），或称为遗传标记，来描述基因的变异, 野生型加“＋”，突变型加“－”（但后者往往被省略），表示的方法的规则如下：
①根据基因产物或作用产物的英文名称，取其单词的第一字母，拼成三个字母并以斜体来表示。如：D NA A denine M ethylase, 即dam 。
②变异基因不同，但引起的结果相同，则用作用结果的英文名称的前三个字母斜体表示，并加上一大写字母，以示区别。如：Recombination , rec A、rec B、rec C。
③某个基因缺失时，在该基因型前加“△”。
④由于某个基因变异导致大肠杆菌的特征发生变化，也可以用该特征的英文名来表示，但第一个字母要大写，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上“-”则表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗性标记为amp r, 敏感性为amp- 。

五、实验过程中菌种的保存和鉴定的重要性

实验过程中，菌种的保存十分重要，特别是那些经过筛选得到的带有阳性质粒的菌株。筛选出来的阳性菌株经常需要转接，而转接过程一方面要防止污染，同时还要防止质粒的丢失。一个最常用的措施是利用抗生素抑制那些丢失质粒的变异菌落的生长，但实际在菌落生长过程中抗生素会失效，导致杂菌污染而影响质粒的收率或蛋白质的表达量。因此注意保存原始菌是非常重要的，必要时在转接前对保存菌进行画线，挑出好的单菌落进行转接，并再保存一份新的菌种。对这种常规操作不可掉以轻心，否则损失是难以弥补的。

参考文献：
1. 李俊明、朱道银、伊正君、江山、骆旭东,分枝杆菌融合表达ICL2GFP 穿梭质粒的构建及鉴定，第四军医大学学报，2005 ;26(1)：9-13
2. Slilaty SN，Lebel S.，Accurate insertional inactivation of lacZ alpha: construction of pTrueBlue and M13TrueBlue cloning vectors. Gene. 1998，213 (1-2)：83-91
3. 王汉中、黄七、司艳红等，一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统，中国病毒学，2002，17(4)：319～325
4. 洪华珠、彭建新，一株高水平表达重组蛋白昆虫细胞系的建立，昆虫学报，2001，44(3)：276～280
5．黄粤、刘德培、梁植权，细菌人工染色体( BAC)及其分析和修饰方法简介，生物化学与生物物理进展，2001，28(3)：309－313 ；
6．陈凡国、张学勇、夏光敏、贾继增，野生一粒小麦BAC 文库的构建和鉴定，植物学报，2002，44 (4)：451-456
7. 昝云红、孙茂盛、郭仁、代长柏，水蛭素变异体I 基因的合成及其在酵母中表达的初步研究，中国医学科学院学报，1998，20（5）：361－366
8. 黄亚东、苏志坚、郑青、赵文、许华、吴晓萍、胡晓辉、李校彷、刘丙萍，人转化生长因子TGF2β3 基因合成及其在大肠杆菌中的表达，中国药科大学学报，2003 ,34 (3) :264～267

四、受体细胞 ：

受体细胞的选择是否合适将关系到能否表达，特别是高效表达。

首先要注意不同的表达载体与受体细胞的关系，即原核表达载体适合原核细胞，真核载体则适合真核细胞，而农杆菌仅适用于植物细胞。即使大肠杆菌质粒，也应注意选择合适的菌种。例如，当用含有T7 噬菌体启动子的载体表达外源基因时，由于T7 启动子只能被其本身的RNA 聚合酶（T7 RNA 聚合酶）所识别，所以必须使用具有产生T7 RNA 聚合酶能力的受体菌，如：BL21（DE3）、JM109（DE3）。对于一些缺失β-D-半乳糖酶氨基端的受体菌，则适合用带lacZ△M15基因的质粒（如：pUC），以便实现β-D-半乳糖酶α互补，进行蓝白斑筛选。

1．选择受体细胞的一般原则：
①易于接纳外源DNA；
②无特异的内源核酸内切酶；
③载体复制、扩增不受阻；
④与载体有互补性。
根据不同的需求，还应考虑：
①表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因型是否匹配；
②遗传稳定性高，易于进行扩大培养；
③受体细胞内源蛋白水解酶基因确失或蛋白酶含量低，利于外源基因蛋白表达产物在细胞内积累；
④可使外源基因高效分泌表达；
⑤对动物细胞而言，所选用的受体细胞对培养的适应性强；如：可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。
⑥受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性；
⑦无致病性；
⑧具有好的翻译后加工机制等。

2．受体细胞的基因型：
由于野生型大肠杆菌的基因（指没有发生突变的基因）具有可塑性，为了满足基因工程中的各种研究或生产的需求，研究人员对它们的基因组进行了改造，使某些基因发生突变或缺失，而引起大肠杆菌的性状特征（表型）发生变化。通常用基因型（Genotype），或称为遗传标记，来描述基因的变异, 野生型加“＋”，突变型加“－”（但后者往往被省略），表示的方法的规则如下：
①根据基因产物或作用产物的英文名称，取其单词的第一字母，拼成三个字母并以斜体来表示。如：D NA A denine M ethylase, 即dam 。
②变异基因不同，但引起的结果相同，则用作用结果的英文名称的前三个字母斜体表示，并加上一大写字母，以示区别。如：Recombination , rec A、rec B、rec C。
③某个基因缺失时，在该基因型前加“△”。
④由于某个基因变异导致大肠杆菌的特征发生变化，也可以用该特征的英文名来表示，但第一个字母要大写，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上“-”则表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗性标记为amp r, 敏感性为amp- 。

五、实验过程中菌种的保存和鉴定的重要性

实验过程中，菌种的保存十分重要，特别是那些经过筛选得到的带有阳性质粒的菌株。筛选出来的阳性菌株经常需要转接，而转接过程一方面要防止污染，同时还要防止质粒的丢失。一个最常用的措施是利用抗生素抑制那些丢失质粒的变异菌落的生长，但实际在菌落生长过程中抗生素会失效，导致杂菌污染而影响质粒的收率或蛋白质的表达量。因此注意保存原始菌是非常重要的，必要时在转接前对保存菌进行画线，挑出好的单菌落进行转接，并再保存一份新的菌种。对这种常规操作不可掉以轻心，否则损失是难以弥补的。

参考文献：
1. 李俊明、朱道银、伊正君、江山、骆旭东,分枝杆菌融合表达ICL2GFP 穿梭质粒的构建及鉴定，第四军医大学学报，2005 ;26(1)：9-13
2. Slilaty SN，Lebel S.，Accurate insertional inactivation of lacZ alpha: construction of pTrueBlue and M13TrueBlue cloning vectors. Gene. 1998，213 (1-2)：83-91
3. 王汉中、黄七、司艳红等，一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统，中国病毒学，2002，17(4)：319～325
4. 洪华珠、彭建新，一株高水平表达重组蛋白昆虫细胞系的建立，昆虫学报，2001，44(3)：276～280
5．黄粤、刘德培、梁植权，细菌人工染色体( BAC)及其分析和修饰方法简介，生物化学与生物物理进展，2001，28(3)：309－313 ；
6．陈凡国、张学勇、夏光敏、贾继增，野生一粒小麦BAC 文库的构建和鉴定，植物学报，2002，44 (4)：451-456
7. 昝云红、孙茂盛、郭仁、代长柏，水蛭素变异体I 基因的合成及其在酵母中表达的初步研究，中国医学科学院学报，1998，20（5）：361－366
8. 黄亚东、苏志坚、郑青、赵文、许华、吴晓萍、胡晓辉、李校彷、刘丙萍，人转化生长因子TGF2β3 基因合成及其在大肠杆菌中的表达，中国药科大学学报，2003 ,34 (3) :264～267

四、受体细胞 ：

受体细胞的选择是否合适将关系到能否表达，特别是高效表达。

首先要注意不同的表达载体与受体细胞的关系，即原核表达载体适合原核细胞，真核载体则适合真核细胞，而农杆菌仅适用于植物细胞。即使大肠杆菌质粒，也应注意选择合适的菌种。例如，当用含有T7 噬菌体启动子的载体表达外源基因时，由于T7 启动子只能被其本身的RNA 聚合酶（T7 RNA 聚合酶）所识别，所以必须使用具有产生T7 RNA 聚合酶能力的受体菌，如：BL21（DE3）、JM109（DE3）。对于一些缺失β-D-半乳糖酶氨基端的受体菌，则适合用带lacZ△M15基因的质粒（如：pUC），以便实现β-D-半乳糖酶α互补，进行蓝白斑筛选。

1．选择受体细胞的一般原则：
①易于接纳外源DNA；
②无特异的内源核酸内切酶；
③载体复制、扩增不受阻；
④与载体有互补性。
根据不同的需求，还应考虑：
①表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因型是否匹配；
②遗传稳定性高，易于进行扩大培养；
③受体细胞内源蛋白水解酶基因确失或蛋白酶含量低，利于外源基因蛋白表达产物在细胞内积累；
④可使外源基因高效分泌表达；
⑤对动物细胞而言，所选用的受体细胞对培养的适应性强；如：可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。
⑥受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性；
⑦无致病性；
⑧具有好的翻译后加工机制等。

2．受体细胞的基因型：
由于野生型大肠杆菌的基因（指没有发生突变的基因）具有可塑性，为了满足基因工程中的各种研究或生产的需求，研究人员对它们的基因组进行了改造，使某些基因发生突变或缺失，而引起大肠杆菌的性状特征（表型）发生变化。通常用基因型（Genotype），或称为遗传标记，来描述基因的变异, 野生型加“＋”，突变型加“－”（但后者往往被省略），表示的方法的规则如下：
①根据基因产物或作用产物的英文名称，取其单词的第一字母，拼成三个字母并以斜体来表示。如：D NA A denine M ethylase, 即dam 。
②变异基因不同，但引起的结果相同，则用作用结果的英文名称的前三个字母斜体表示，并加上一大写字母，以示区别。如：Recombination , rec A、rec B、rec C。
③某个基因缺失时，在该基因型前加“△”。
④由于某个基因变异导致大肠杆菌的特征发生变化，也可以用该特征的英文名来表示，但第一个字母要大写，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上“-”则表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗性标记为amp r, 敏感性为amp- 。

五、实验过程中菌种的保存和鉴定的重要性

实验过程中，菌种的保存十分重要，特别是那些经过筛选得到的带有阳性质粒的菌株。筛选出来的阳性菌株经常需要转接，而转接过程一方面要防止污染，同时还要防止质粒的丢失。一个最常用的措施是利用抗生素抑制那些丢失质粒的变异菌落的生长，但实际在菌落生长过程中抗生素会失效，导致杂菌污染而影响质粒的收率或蛋白质的表达量。因此注意保存原始菌是非常重要的，必要时在转接前对保存菌进行画线，挑出好的单菌落进行转接，并再保存一份新的菌种。对这种常规操作不可掉以轻心，否则损失是难以弥补的。

参考文献：
1. 李俊明、朱道银、伊正君、江山、骆旭东,分枝杆菌融合表达ICL2GFP 穿梭质粒的构建及鉴定，第四军医大学学报，2005 ;26(1)：9-13
2. Slilaty SN，Lebel S.，Accurate insertional inactivation of lacZ alpha: construction of pTrueBlue and M13TrueBlue cloning vectors. Gene. 1998，213 (1-2)：83-91
3. 王汉中、黄七、司艳红等，一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统，中国病毒学，2002，17(4)：319～325
4. 洪华珠、彭建新，一株高水平表达重组蛋白昆虫细胞系的建立，昆虫学报，2001，44(3)：276～280
5．黄粤、刘德培、梁植权，细菌人工染色体( BAC)及其分析和修饰方法简介，生物化学与生物物理进展，2001，28(3)：309－313 ；
6．陈凡国、张学勇、夏光敏、贾继增，野生一粒小麦BAC 文库的构建和鉴定，植物学报，2002，44 (4)：451-456
7. 昝云红、孙茂盛、郭仁、代长柏，水蛭素变异体I 基因的合成及其在酵母中表达的初步研究，中国医学科学院学报，1998，20（5）：361－366
8. 黄亚东、苏志坚、郑青、赵文、许华、吴晓萍、胡晓辉、李校彷、刘丙萍，人转化生长因子TGF2β3 基因合成及其在大肠杆菌中的表达，中国药科大学学报，2003 ,34 (3) :264～267

四、受体细胞 ：

受体细胞的选择是否合适将关系到能否表达，特别是高效表达。

首先要注意不同的表达载体与受体细胞的关系，即原核表达载体适合原核细胞，真核载体则适合真核细胞，而农杆菌仅适用于植物细胞。即使大肠杆菌质粒，也应注意选择合适的菌种。例如，当用含有T7 噬菌体启动子的载体表达外源基因时，由于T7 启动子只能被其本身的RNA 聚合酶（T7 RNA 聚合酶）所识别，所以必须使用具有产生T7 RNA 聚合酶能力的受体菌，如：BL21（DE3）、JM109（DE3）。对于一些缺失β-D-半乳糖酶氨基端的受体菌，则适合用带lacZ△M15基因的质粒（如：pUC），以便实现β-D-半乳糖酶α互补，进行蓝白斑筛选。

1．选择受体细胞的一般原则：
①易于接纳外源DNA；
②无特异的内源核酸内切酶；
③载体复制、扩增不受阻；
④与载体有互补性。
根据不同的需求，还应考虑：
①表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因型是否匹配；
②遗传稳定性高，易于进行扩大培养；
③受体细胞内源蛋白水解酶基因确失或蛋白酶含量低，利于外源基因蛋白表达产物在细胞内积累；
④可使外源基因高效分泌表达；
⑤对动物细胞而言，所选用的受体细胞对培养的适应性强；如：可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。
⑥受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性；
⑦无致病性；
⑧具有好的翻译后加工机制等。

2．受体细胞的基因型：
由于野生型大肠杆菌的基因（指没有发生突变的基因）具有可塑性，为了满足基因工程中的各种研究或生产的需求，研究人员对它们的基因组进行了改造，使某些基因发生突变或缺失，而引起大肠杆菌的性状特征（表型）发生变化。通常用基因型（Genotype），或称为遗传标记，来描述基因的变异, 野生型加“＋”，突变型加“－”（但后者往往被省略），表示的方法的规则如下：
①根据基因产物或作用产物的英文名称，取其单词的第一字母，拼成三个字母并以斜体来表示。如：D NA A denine M ethylase, 即dam 。
②变异基因不同，但引起的结果相同，则用作用结果的英文名称的前三个字母斜体表示，并加上一大写字母，以示区别。如：Recombination , rec A、rec B、rec C。
③某个基因缺失时，在该基因型前加“△”。
④由于某个基因变异导致大肠杆菌的特征发生变化，也可以用该特征的英文名来表示，但第一个字母要大写，并加上“+”或“r”表示有抗性, 加上“-”则表示敏感。如：Ampicillin(氨卞青霉素)，抗性标记为amp r, 敏感性为amp- 。

五、实验过程中菌种的保存和鉴定的重要性

实验过程中，菌种的保存十分重要，特别是那些经过筛选得到的带有阳性质粒的菌株。筛选出来的阳性菌株经常需要转接，而转接过程一方面要防止污染，同时还要防止质粒的丢失。一个最常用的措施是利用抗生素抑制那些丢失质粒的变异菌落的生长，但实际在菌落生长过程中抗生素会失效，导致杂菌污染而影响质粒的收率或蛋白质的表达量。因此注意保存原始菌是非常重要的，必要时在转接前对保存菌进行画线，挑出好的单菌落进行转接，并再保存一份新的菌种。对这种常规操作不可掉以轻心，否则损失是难以弥补的。

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