氯化钙法进行质粒转化

利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形。

仪器用具：

37℃培养箱；42℃水浴；冰浴

实验步骤：

0.1 M CaCl2置冰浴中

2 M glucose：

取18 g glucose溶于水中，并调体积至50 mL，无菌过滤，分装后置 -20℃贮存。

2 M Mg2+：

取20.3 g MgCl2 · 6H2O及24.65 g MgSO4 · 7H2O溶于水中，并调体积至100mL，无菌过滤的，分装小瓶置 -20℃贮存。亦可以MgCl2完全取代MgSO4.

SOB 液体培养基：

32 Methods in Biotechnology Vol 1

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,高压灭菌，使用前加入2 M Mg2+，使最终浓度为10 mM.

SOB 固体培养基：

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.5% Bactoagar,高压灭菌，倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM.

SOC/Amp 固体培养基：

SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin.

SOC 液体培养基： SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）。

大肠杆菌菌株： JM109

#1~#5 接合反应液

方法步骤：

1） 进行转形实验前16~20 h,自 -70℃取出贮存的菌种，以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上，在37℃培养。

2） 取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶 （请记得加入Mg2+）。 另取1 mL SOB加于微量离心管中。 由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入40 mL SOB中，于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计

3） 收集菌液于离心管中，置冰浴中10~15 min.

4） 以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。

5） 倒去上清，并尽量将液体倒干，或以微量移液器头吸干净。

6） 沉淀加入1/3 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl2,稍加震荡，混合均匀，置冰浴中10~15 min.

7） 同上4）， 5） 的操作。再重复6）， 4）， 5） 的操作，以使反应更完全，增加成功率。

8） 加入1/25 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl₂，稍加震荡使混合均匀。

◆ Competent cells 制备完成！

9） DNA 样品 （<10 μL） 先装于微量离心管中，置冰浴中预冷，另取一微量离心管，标上 #0,不加入任何DNA （作为negative control），亦置冰浴中预冷。

每个样品加入200 μL 菌液，震荡混合后，置冰浴中20~40 min.

10） 42℃加热90 s （温度及时间均需很准确，请事先检查水浴锅的温度，不可超过42℃）。

◆ Heat shock!

11） 置冰浴中2 min。

12） 加入800 μL SOC，混合后，于37℃震荡培养30~60 min.

13） 将各管转形液上下摇动混合均匀后。#5 取20 μL 至另一离心管中，加入180μL SOC （稀释10 倍），混合均匀后，涂布于SOC/Amp plate. #0, #1~#4 各取200 μL 涂抹在SOC/Amp plate. 剩余菌液以6,000 rpm 离心1 min,倒去上清，沉淀加入200 μL SOC，均匀打散后涂抹在另一个SOC/Amp plate 上。

14） 待培养基表面的菌液完全被吸收后，倒置培养皿于37℃培养16~20 h 后，观察各个plate 上菌落的形状并计算菌落数。