RNA 的制备与分析

RNA:主要由四种核糖核苷酸组成，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U）。天然的RNA并不象DNA那样呈双螺旋结构，而是单链线形分子。只有局部区域为双螺旋结构（约占RNA分子的50%）。RNA分子中的核苷酸至少75个，多的可达数千个。

RNA的分类：（1）信使RNA（mRNA）（2）转移RNA（tRNA）（3）核糖体RNA（rRNA）（4）小RNA（snRNA）

常用的RNA分析方法：（1）RT-PCR（Reverse Transcription PCR）（反） 逆转录聚合酶链反应（2）原位杂交（In situ hybridization）（3）Northern Blot（4）RNA斑点和狭线杂交（5）S1核酸酶作图法（6）引物延伸法。

一、RNA的提取与纯化：

（一）控制RNA酶的活性：

1、控制污染：

（1）专用的RNA操作室、专用器械。

（2）操作时戴口罩、帽子、手套。

（3）实验用器皿、吸头、离心管应为新的。

（4）所配制的水溶液，尽可能用DEPC处理。

2、已污染RNA酶的器具的处理

（1）在180℃的高温下干烤8小时或更长时间。

（2）氯仿冲洗。

（3）双氧水浸泡。

（4）0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水浸泡。

3、常用的RNA抑制剂：

（1）焦磷酸二乙酯（DEPC）：一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应从而抑制酶的活性。

（2）异硫氰酸胍：最有效的RNA酶抑制剂。在裂解组织细胞的同时，也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中分离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

（3）氧钒糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，与RNA酶结合后几乎能完全抑制RNA酶的活性。

（4）RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从人胎盘中分离出来，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

（5）其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。

（二）RNA的提取：

常用的RNA提取方法：

异硫氰酸胍法、盐酸胍法、RNAzol法。

RNAzol法的特点：方便、快速、得率高。但所用试剂价格贵，仅适用于小量提取。

组织中总RNA的Trizol法提取

1、取新鲜组织约50-100mg，加入1 ml Trizol。室温充分匀浆，静置5分钟。

2、加入0.2 ml氯仿，振荡15秒，静置2分钟。

3、4℃，12000g×15分钟，取上清。

4、加入0.5 ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟。

5、 4℃，12000g×10分钟，弃上清。

6、加入1 ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4℃，7500g×5分钟，弃上清。

7、晾干，加入适量的DEPC水溶解（65 ℃促溶15分钟）。

8、定量：在紫外分光光度计上测定OD260和OD280。

RNA样品处理：

1、变性胶配制

2、RNA样品处理

3、电泳

4、紫外灯观察

（三）RNA的纯化：

采用Oligo dT-纤维素，从总RNA中分离出mRNA.该法利用mRNA 3‘末端有Poly（A）的特点，在总RNA流经寡聚（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下， mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时，mRNA被洗脱下来。一般而言，经过二次Oligo dT柱后，可得到较高纯度的mRNA。

二、RNA分析：

（1）RT-PCR（Reverse Transcription PCR）（反） 逆转录聚合酶链反应

（2）Northern Blot

（3）原位杂交（In situ hybridization）

（一）RT-PCR：

原理：提取组织细胞总RNA，以其中的mRNA为模板，采用olig-dT或随机引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。

应用：分析基因的转录产物；获取目的基因；合成cDNA探针；构建RNA高效转录系统。

1、反（逆）转录酶的选择：

（1）鼠源性反转录酶（MMLV）

（2）禽源性反转录酶（AMV）

（3）嗜热微生物反转录酶

（4）MMLV反转录酶RNase H 实变体

2、合成cDNA的引物的选择：

（1）随机六聚体引物

（2）olig （dT）

（3）基因特异性引物

方法：

提取组织或细胞总RNA→紫外定量→逆转录合成cDNA→PCR扩增→电泳→摄像→光密度扫描→图像分析

3、注重事项：

（1）RNA的质量。

（2）非特异性扩增，设阴性对照。

（3）平台期。

（4）内参 （看家基因 house keeping gene）。

（5）DNA污染。

（二）Northern Blot ：

原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。

应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。

方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗膜→压片→洗片→图像分析

注重事项：

（1）RNA的完整性。（2）转膜完全。（3）探针标记的效率、变性。（4）防同位素污染。（5）压片曝光时间。

探针（ probe）：

定义：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特别的标记物。

常用的核酸探针：

（1）双链cDNA ；（2）单链cDNA；（3）合成寡核苷酸；（4）单链cRNA。

探针所携带的标记物应具备的条件：

（1）标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱其配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。

（2）标记探针的检测方法简便、省时、正确可靠、重复性好、敏捷度高。

（3）稳定性好、环境污染少、价廉。

常用的探针标记物：

1、放射性同位素：³H、³²P、³⁵S、¹²⁵I等。

2、非放射性同位素：地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。

探针标记法：切口移位（平移）法；引物延伸法；末端标记法；体外转录法等。

探针的纯化：层析法；沉淀法。

α-³²P cDNA探针标记：

（1）取模板DNA 25ng在离心管中。变性，冰浴。

（2）dNTPmix制备：dGTP、dATP、dTTP等量混合。

（3）将下列反应成份混合，加入上述离心管中： dNTPmix 2.0μl、 BSA 1.0μl、 5×Buffer 5.0μl、 Klenow 酶1.0μl、 α-³²P-dCTP 2.5μl.

加入双蒸水适量，使反应总体积达25μl，轻轻混匀。室温下反应1小时。

预杂交：

常用的封闭物：

（1）变性的非特异性DNA；鲑鱼精子DNA；小牛胸腺DNA

（2）高分子化合物：Denhardt's溶液（含葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白等）。

杂交：

（1）离子强度：6×SSC

（2）DNA探针长度

（3）温度：低于Tm（熔解温度）15-25℃

（4）时间：16小时

洗膜

压片

膜的重复使用

（三）原位杂交：

原理：含有互补顺序的标记DNA或RNA片段（探针），在相宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。

应用：观察目的基因或mRNA 在细胞中的定位；半定量分析其含量变化。

直接法：用放射性同位素、荧光素、酶标记的探针与细胞内靶核苷酸形成杂交体，通过放射自显影、荧光显微镜或成色的酶促反应直接显示结果

间接法：用半抗原标记探针，最后采用免疫组织化学法对半抗原定位，间接显示探针与靶核苷酸形成的杂交体。

方法：

1、玻片：

洗→酸处理→冲洗→烤→粘附剂

常用的粘附剂：多聚赖氨酸、明胶、3-氨丙基三乙氧硅烷（APES）。

原位杂交专用玻片。

2、取材、固定：

（1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。

3、组织切片的处理：

（1）脱蜡：石蜡影响探针的穿透性。

（2）去污剂处理：增加组织通透性。

（3）蛋白酶消化：使经固定后被遮蔽的靶核苷酸探针的杂交能力。

（4）酸酐和酸处理：防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景。

（5）杂交缓冲液孵育：阻断载玻片或组织标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，以降低背景。

（6）内源性生物素和酶的抑制：防止假阳性。

4、杂交：

（1）探针长度：以50-300bp为宜。

（2）探针变性：95℃，5-10分钟。

（3）探针浓度：

放射性同位素：0.5ng/μl；

非放射性同位素：2ng/μl。

（4）杂交温度：应低于杂交体融解温度（melting temperature，Tm）20-30℃。

（5）杂交时间：18-24小时。

5、杂交后处理：

去除未参予杂交体形成的过剩的探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，以降低背景。

6、对照试验

阳性、阴性、组织对照。