甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)
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第一部分 基因组DNA的提取
这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节:
1、蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;
2、RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了。两者均于-20℃保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二:
1、紫外分光光度计计算OD比值;
2、1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
第二种方法优于第一种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰。
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水(ddH2O)均经高压蒸汽灭菌。
1、将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用ddH2O稀释至50μl;
2、加5.5ul新鲜配制的3M NaOH;
3、42℃水浴30min;
以下步骤在水浴期间配制:
4、10mM 对苯二酚(氢醌),加30μl至上述水浴后混合液中(溶液变成淡黄色);
5、3.6M 亚硫酸氢钠(Sigma,S9000),配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用ddH2O稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520μl至上述水浴后溶液中;
6、EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液;
7、加200μl石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化;
8、50℃避光水浴16h。
这一步需要注意的细节:
1、基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4μg;
2、所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确;
3、亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收;
4、水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全。