甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)

第一部分 基因组DNA的提取

这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：

1、蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

2、RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20℃保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：

1、紫外分光光度计计算OD比值；

2、1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

第二种方法优于第一种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出，所用双蒸水（ddH2O）均经高压蒸汽灭菌。

1、将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用ddH2O稀释至50μl；

2、加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；

3、42℃水浴30min；

以下步骤在水浴期间配制：

4、10mM 对苯二酚（氢醌），加30μl至上述水浴后混合液中（溶液变成淡黄色）；