过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法

一、原理

过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

R（Fe2+）+H2O2⇒R（Fe3++OH-）

R（Fe3++OH-）2+H2O2⇒R（Fe2+）2+2H2O+O2

据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2。

5H2O2+2KMnO4+4H2SO4⇒5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

即可求出消耗的H2O2的量。

二、仪器和用具

研钵；三角瓶50ml 4个；10ml酸式滴定管；恒温水浴锅；容量瓶25ml 1个。

三、试剂

10%H2SO4；

0.2mol/L磷酸缓冲液PH7.8；

0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；

0.1Mol/L H2O2：市售30%H2O2大约等于17.6Mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1Mol KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；

0.1Mol/L草酸：称取优级纯H2C2O2·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。

四、方法

1. 酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2. 取50ml三角瓶4个（2个测定，2个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO4 2.5ml。

3. 用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。

4. 结果计算：酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：

酶活（Mg/g·Min）=（A-B）×VT×1.7FW×V1×t　　　　　　　 （3-2）

式中：A：对照KMnO4滴定毫升数（ml）；B：酶反应后KMnO4滴定毫升数（ml）；VT：酶液总量（ml）；V1：反应所用酶液量（ml）；W：样品鲜重（g）；1.7FW：1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mgH2O2。

五、注意

所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。