CHO细胞表达系统常见问题及解析

1、问：请问有人养过CHO细胞吗？文献报道说用DMEM培养基来养，但我不太清楚具体是高糖还是低糖？

参考见解：CHO细胞用高糖DMEM养就可以了，比较好养，10%血清，小牛和胎牛都可以，长得比较慢，跟你所用的血清有一定的关系，大概需要两天传一次代。在塑料板上比玻璃板上好养，感觉如果在玻璃板上养而且不包被的话，好像细胞不易伸展开来。

2、问：要转染钾通道pcDNA3.1入细胞，是选cho细胞呢还是hek293细胞？cho细胞转染效率高吗？

参考见解：表达一个蛋白的时候，首先要确认你的蛋白确实表达了，因为有很多原因可以导致蛋白表达出问题（质粒序列有错误，质粒纯度低，表达的蛋白不稳定，转染效率太低等）。所以在做任何功能性实验之前，必须要先确认蛋白的表达，通常的实验有：

（1）采用免疫荧光法。由于需要荧光二抗，比较贵。但直观，可以确定转染效率，采用好的显微镜时，可以大致知道表达蛋白在细胞中的位置。

（2）WESTERN-BLOT。可以确认表达的蛋白分子量，以及表达的量。但不直观。

（3）构建一个N或C端带荧光蛋白的质粒。这样比较费时间，同时携带的荧光蛋（通常使用GFP）有可能干扰蛋白的正常功能。但好处是转染后可以很方便的观察转染效率，蛋白在细胞中的位置等。

当然以上方法都无法知道质粒有无发生突变，所以如果你的蛋白有表达但没有功能，首先要做一个DNA测序确认你的序列没有问题。事实上质粒发生突变的机会比大多数人想象的要多得多！

3、问：由于我要用CHO细胞生产基因工程抗体，用什么培养基能够很好的使之良好的生长。

参考见解：培养CHO细胞最好用F12，并且由于F12中加入了一些微量元素与无机离子，因此可以在血清很少的情况下应用，是无血清培养中常用的基础培养基，特别适合进行单细胞培养和克隆化培养。我们的前辈曾用F12在无血清的条件下成功的克隆出CHO细胞。

无血清培养CHO细胞有两种方法：一种是直接向试剂公司购买只适用于培养CHO细胞的无血清培养基（好像HyClone就有）；第二种方法实际上是有血清培养，只不过血清浓度很低罢了，可以近似的认为无血清。

在第二种方法里，又可以分出两条途径：你可以分步进行，也可以一步到位。分步法是，CHO细胞先在含10％血清的常规培养基里培养，再到含5％血清的培养基里培养，再到含2.5％血清的培养基里培养，依此类推，培养基里的血清不断下降，直到一个能让CHO细胞良好生长的最低血清浓度。一步到位法就是省去中间的步骤，直接由起点的血清浓度到终点浓度。

4、问：我要做稳定转染，表达融合蛋白并将蛋白质纯化来检测其功能。仅仅把目的基因插入pcDNA3.1，没有插入其他的基因或者tag。现准备转染CHO细胞。就相关问题想问问：

有的文献上没有署名K1或是DHFR,普通所写的CHO细胞是指那种？野生型CHO细胞又是指的哪种？这三种细胞是不是因为CHO-K1和CHO/DHFR-有扩增基因GS 和DHFR,可以更为有效的扩增进而表达，比野生型CHO在转染中更起作用？

如果就我的实验要求，CHO-K1或者CHO/DHFR-更加适合，那么转染CHO-K1是不是可以直接转染？而转染CHO-DHFR-需要和携带DHFR-的标记质粒共转染？

参考见解：

做稳定表达是需要把目的基因克隆到一定的载体上的，这个载体同时可以过表达一个抗性基因，如果载体整和到基因组上，这个抗性已经能够克服筛选压力，而这个时候你的目的蛋白也得到了有效的表达。

（1）野生型CHO就是ＣＨＯ－Ｋ１

（2）CHO－DHFR-是指ＤＨＦＲ缺陷型细胞，ＤＨＦＲ作为筛选标记．

（3）你用pcＤＮＡ3.1的话,可以直接转染CHO-K1,加G418筛选即可.

5、问：最近作试验需要用到CHO细胞，老师从广西带回两瓶，本来用的是DMEM培养液，由于我没有接触过细胞这方面的知识，上网查了下培养液，说1640就可以，就仓促用了1640，两天过去了贴壁很不好，估计是要完了，求救。

参考见解1：

（1）带回来的细胞瓶汇合度大概多少？一般送人的细胞汇合度大概80－90％，且瓶里加满培养液，再包装。细胞生长旺盛，便于处理。加满培养液的目的是防止运输过程中倒置，细胞接触不到培养液而死亡或活力下降。培养时应该分瓶培养。我想你应该分瓶了吧，我们一般1:3分瓶。不分瓶培养可想而知了。

（2）如果上述没错的话，准备好正确的完全培养液，将生长不好的细胞瓶中的细胞消化收集，合并一下，铺底大概30％。正常培养。

（3）关键掌握住起始细胞的密度和严格的操作。因为这细胞已很常见。方法正确不存在长不好的问题。除非你的老师带回来的细胞存在问题。

参考见解2：37度预热胰酶，吸除培养瓶中的培养液，PBS（无钙镁）洗涤细胞1次后，加入少量胰酶，覆盖细胞即可。轻轻摇动（前后左右）。镜下观察细胞状态，一旦出现细胞回缩形态变圆即停止消化（防止过渡消化）。加入完全培养液（必须含胎牛血清）终止消化反应。湾头吸管顺序吹打细胞，小心避免产生气泡（对细胞有害）。镜下观察细胞，细胞分散即可后续操作。如果是新手，保留上清以防不测，别倒掉。

6、问：最近要养CHO细胞,要作些准备,但不知道其培养也是什么,谢谢

参考见解：这是一篇已发表的CHO细胞培养的方法.

CHO细胞培养：CHO细胞株置于RPMI 1640 培养基中，内含10%灭活小牛血清，青霉素100 IU/mL，链霉素100 IU/mL，置于37℃，5%CO2的培养箱（德国Heraeus）中培养。每隔48 h换培液，当单层培养细胞汇合以后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。 将培养瓶中的CHO细胞按1×105/mL传代移入培养板中，待进入对数生长期后（约24 h）加药。

这是细胞的供给源:

CHO细胞由中科院上海生物化学和细胞生物学研究所提供。

7、问：这两个月，CHO细胞在反应器上总是在前两天很难密度长上去，同期转瓶生长正常，基本排除细胞及培养基的问题，换罐做也出现同种现象，可排除反应器问题。与曾经在此罐上正常生长的一批相比，只是接入培养液体积由1.5升该为0.8升，其他条件均相同，反应器控制系统无异常。不知问题到底出在什么地方，恳请各位不吝赐教！不胜感激！

参考见解：根据我自己的经验，如果你的种子细胞和培养基都确保没问题的话，试试一下几点：

（1）接种时留一些细胞悬液，种回到方瓶或转瓶中，用与大罐相同的培养基同时培养，观察48小时内的生长情况，如果方瓶长势良好而罐子有问题，那就是操作的问题了

（2）不知道你的罐子800mL能否确保搅拌、通气等参数的控制效率，只看仪表显示是不够的，有时液位太低可能探测到的不是真实值，你可以在接种前用水试试，把各种条件设的极端一些，容易发现问题

（3）有可能的话再做一次1.5L培养，看能否重现6月的结果，因为你说所有条件都一样可能是不准确的，有疏漏的地方

8、问：我培养的cho细胞,在塑料基质的方瓶中贴壁和生长情况很好,形态也很正常,但是接入转瓶后贴壁情况很差,不伸展或伸展需要的时间很长.请问这主要是什么原因?

参考见解：我觉得可能的原因有如下几点：

（1）细胞本身贴壁生长的能力较弱，一般细胞在塑料器皿上的贴附能力强于玻璃器皿，这样的话，就选择塑料器皿好了。其实塑料培养瓶等也是可以重复使用的，清洗干净，泡酸，冲洗干净，凉干之后，射线照射消毒或者就是紫外消毒也行，我们实验室就这样重复用培养板，没有什么问题。当然，太旧的还是扔了好了。

（2）培养液PH不好也会影响贴壁，配的时候加好缓冲试剂，不嫌麻烦的话调定PH在7.2左右。使用时间较长的培养液由于在空气中暴露时间长，ph会有变化

（3）消化时候处理不合适，比如胰酶消化过久，有EDTA的话，去除不干净也影响贴壁的。消化完了之后要吸干净消化液，用培养液漂洗细胞，或者吹下来之后离心，换加新鲜培养液

（4）血清也可能影响贴壁，我观察过，细胞在胎牛血清中贴壁明显快于新生牛血清，尤其是Hyclone的血清，不过很贵

试试吧，有耐心点，等等它总会铺展开的

9、问：最近我养CHO细胞，是从别人那里得来得。给我得时候细胞有一半是圆形一半是梭行的。但是养着养着就大部分成圆形，而且有的像荷包蛋一样，而那些还是梭形的细胞里面出现了空泡一样的东西，还有渐渐像融化了一样。是什么原因，我一直很头疼，不知道该怎么办，下面的实验无法进行，苦恼啊！

参考见解：听您的描述估计很可能是支原体污染。

建议马上丢弃该细胞，因为支原体污染很难去除，为避免影响您实验室其他的细胞操作一定不要犹豫。您可以重新索取或购买状态好的CHO细胞。

10、问：由于接种密度稍低一些，CHO细胞在2L转瓶中培养5天左右很难消化下来，即使消化下来也是成团的，请问为什么？加完血清的培养基又重新过滤了，会不会对细胞的生长速度有影响，一般培养三天就能张满，谢谢

参考见解：

（1）首先考虑一下你的胰酶有没有问题，也有可能是胰酶的浓度不够？

（2）成团也可能是细胞太多了，因此在消化时应该延长消化的时间，同时传代时尽量吹散成单细胞悬液！

（3）消化后传代时多弃去些细胞试试，也可以多传几瓶，三瓶，四瓶都是可以的！