噬菌体展示抗体库构建的载体
抗体库技术是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体
单链抗体（ScFv）是一种基因工程抗体，能够在原核宿主中表达，不论是在性能方面，还是在制备方面，均具有独特的优越性。关于基因工程抗体的特点与制备过程，见本书第一章的有关内容。这里仅介绍噬菌体展示技术在制备单链抗体中的应用，说明该技术的操作过程。
pFUW80是一个多拷贝的噬菌粒载体,用于表达单链抗体基因。它同时具有colEl的复制起始位点和丝状噬菌体f1的复制起始位点。但是,pFUW80缺少编码噬菌体复制和包装所需蛋白的基因,这些基因均由辅助噬菌体提供。这样,pFUW80既可以进行一般质粒的双链复制;在辅助噬菌体存在下,又能像丝状噬菌体那样滚环复制。常用的辅助噬菌体有VCM13和M13KO7,它们带有一个编码卡那霉素抗性基因,可以作为筛选的标志。
pFUW80表达抗体基因使用的是lacZ启动子,载体本身并不带有lacIq基因,要求使用染色体上带有一个lacIq基因的宿主菌株。由于pFUW80是多拷贝载体,所以宿主菌的lacIq基因产物不足以抑制多拷贝lacZ启动子转录,导致P3-抗体融合蛋白的表达存在着较强的渗漏。因此,即使不用IPTG诱导也能表达相当数量的融合蛋白,IPTG诱导仅能使表达产量提高3～6倍。
为了使融合蛋白定位在周质腔,需要将融合蛋白基因与编码信号肽的一段DNA融合,用信号肽将融合蛋白引导到细菌细胞膜上,再与噬菌体的其他组分组装成病毒颗粒。常用的信号有3种,pFUW80使用的是Erwinia carotovora的pelB信号肽。
pelB基因编码E.carotovora的果胶酶,其信号肽包括21(或22)个疏水氨基酸残基,其序列如下：-MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAM(A)-,其相对应的密码子经过修改以利于E.coli翻译系统的识别,序列为:ATG-AAA-TAC-CTA-TTG-CCT-ACG-GCA-GCC-GCT-GGA-TTG-TTA-TTA-CTC-GCT-GCC-CAA-CCA-GCG-ATG-(GCC)-。 当信号肽牵引着抗体-P3融合蛋白定位于周质腔后,信号肽酶作用于其第21位的Met或第22位的Ala C-侧,切下抗体-P3融合蛋白分子。
在pelB与基因Ⅲ之间引入一段人工合成的寡核苷酸序列。这段序列中包含了抗体VH和VL基因的克隆位点,在重链和轻链之间还有一段连接肽序列,pFUW80的连接肽序列为(GGGGS)3,这个序列具有较大的柔性,不影响抗体分子的空间构象及抗体分子与抗原的特异性结合。在轻链EcoRI位点之后,有一段5个His的串联序列,便于用二价金属离子进行金属螯合层析,纯化抗体蛋白。
在抗体基因与基因Ⅲ之间设计了一个UAG终止密码子,当在琥珀突变型菌株(supE)表达时,UAG被通读为Gln,表达产物为ScFv-P3融合蛋白，附着在噬菌体表面。当在非抑制型菌株中表达时,就会在UAG处翻译终止,产生分泌型的ScFv分子。所以pFUW80称为附着型-外分泌双功能表达载体。在基因Ⅲ的3端有两个连续的终止密码子,这种终止信号保证融合基因的翻译在这里结束。
pFUW80上的β-lactamase基因提供了氨苄或羧苄青霉素抗性,作为筛选标志。pFUW80与辅助噬菌体提供不同的抗性标志,以保证超感染的成功。
pFUW80载体上设计的VH基因插入位点XhoI-SpeI,VL基因插入位点XbaI-EcoRI,必需与PCR引物上设计的酶切位点一致。在载体的其他位置不能再有这些位点,如果有的话,要利用定点突变技术去掉。pFUW80的上述特点使得它不仅用作表达载体,也适用于定点突变和单链测序。
