关于萤火虫荧光素酶检测的化学发光应用实例

一、简介

多种化学和生物发光方法目前已用于基础生化和微生物研究、分析生化、分子毒理学、药学和环境生物学领域 (3) 。萤火虫的荧光素 - 荧光素酶系统是最早建立的发光模型之一 (4) ，仍被广泛用于发光应用中，并且是检测 ATP 的最灵敏的方法 (1) 。与细胞外基质相比，活细胞表现出更高的 ATP 浓度，并且多数细胞生命活动与 ATP 浓度的变化相关。

在最佳的反应条件和较低的 ATP 浓度下，光强度与 ATP 浓度成线性关系，如下面式子所示：

因此，萤火虫检测法能被用于检测任何能够形成或降解 ATP 的酶或代谢物。典型的将萤火虫荧光素酶用于分子生物学领域是在关于 真核生物 DNA 的表达调节研究中被用作评价基因转染的报告基因 (2, 5) 。

在这个应用实例中，我们描述了荧光素酶检测的两个例子 PicaGene LT 2.0 和 LT 7.5 luciferase kits (Toyo Ink 制造 , Wako Pure Chemical Ind., Ltd. 销售 ) 。 使用辅酶 A （ CoA ） , 发光反应的时间明显延长；对于 PicaGene LT 2.0 曾报道过两小时的发光时间，对于 PicaGene LT 7.5 ， 7.5 小时的发光时间已被确认。这两种试剂盒都具有稳定的缓慢发光特征 , 这使得他们既适合单独使用，也适合与自动化系统联合应用于高通量筛选。

二、实验步骤

1、检测程序

使用 ULTRA 多功能荧光检测系统 检测 PicaGene LT 2.0和PicaGene LT 7.5的发光强度。

2、试剂盒成分

试剂盒 1 的成分

PicaGene LT 2.0 (Wako product code no. 305-05886)

PicaGene (Firefly) Substrate Solution, ready for use

PicaGene (Firefly) Luciferase Standard Solution

试剂盒 2 的成分

PicaGene LT 7.5 (Wako product code no. 302-05891)

PicaGene (Firefly) Substrate Solution, ready for use

PicaGene (Firefly) Luciferase Standard Solution

试剂

PicaGene Cell Lysis Buffer LUC/PGC-50, stock solution, 5-fold concentration

3、试剂的准备和加样

（1）准备荧光素酶的稀释缓冲液

将 5x PicaGene 细胞裂解缓冲液稀释五倍，得到含有 1mg/ml BSA ( 胎牛血清 ) 的 1x PicaGene 细胞裂解缓冲液

（2）荧光素酶的梯度稀释

在 eppendorf 管中用 1x 稀释缓冲液将荧光素酶标准溶液连续十倍稀释得到 8 个浓度（ 10 -8 到 10 -15 g/μl ）。每个浓度取 10μL 加入微孔板中，做两个重复（如 figure 2 ）。在三个空白对照孔中加入 10 μl 1x 稀释缓冲液。

（3）添加底物溶液

用连续液体分配器 (eppendorf 4780) 将 100μL 平衡至室温的底物 (PicaGene Substrate Solution) 加入含有荧光素酶的孔中和空白对照孔中，振板混匀溶液。在发光反应的开始阶段，板上各孔间上样时间的差异可能会引起信号差异，因此为了得到稳定的发光和好的精度建议等待 20 分钟再测量。

4、测量及仪器设置

积分时间 : 1000 ms
板型 : 96 孔板 ( 平底白色，未灭菌，未处理 )

5、典型的结果

PicaGene LT 2.0 和 PicaGene LT 7.5 发光强度的时间依赖性

对发光强度做了 3 小时的观察。 LT 2.0 起初的发光强度较高而发光时间短， LT 7.5 在观察时间范围内持续发光。

PicaGene LT 2.0 和 PicaGene LT 7.5 检测的灵敏度

Figure 4 的测量数据显示了低 ATP 浓度并且底物过量的条件下荧光信号和酶浓度的线性关系。得到了以下的检测极限： LT 2.0 = undefined10 -13 g/well (?), PicaGene LT 7.5 =undefined10 -13 g/well (?) 。虽然 LT 7.5 发光时间较长，但在同样的荧光素酶浓度下， LT 2.0 发光更强。因此使用 PicaGene LT 2.0 灵敏度更高。

三、结论

在这篇应用实例中，通过联合使用 ULTRA 多功能荧光检测系统 和 PicaGene LT 2.0 、 LT 7.5 对发光定量研究，建立了多种化学发光应用的最优条件。 PicaGene LT 试剂盒已被证明具有高稳定性、出色的灵敏度和长发光时间的特点，这使其适用于多种研究应用和自动化的大通量筛选。

四、参考文献

1、CAMPBELL, A.K. (1988): Chemiluminescence. Principles and Applications in Biology and Medicine. VCH Publishers, Ellis Horwood Ltd., Chichester. ISBN 0-89573-501-6

2、DE WET, J.R. et al. (1985): Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Eschericha coli. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 , 7870.

3、LAROSSA, R. (1998): Bioluminescence methods and protocols. Methods in molecular biology,volume 102. Humana Press, Totowa. ISBN 0-89603-520-4

4、MCELROY, W. D. (1947): The energy source for bioluminescence in an isolated system. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 33 , 342-345.

5、WOOD, K. V. et al. (1984): Synthesis of active firefly luciferase by in vitro translation of RNA obtained from adult lanterns. Biochem. Biophys. Res. Com. 124, 592.

6、WOOD, K. V. et al. (1991) In: Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status, eds. P.Stanley and L. Kricka, John Wiley and sons, Chichester, 11