荧光寿命（ FLT）检测

摘要

这个技术手册介绍了荧光寿命（ FLT）这种新技术的基本原理。从这本技术手册里，我们可以简单的了解与这项技术相关的理论基础和与之配合的实验条件，以及通过一项应用实例讨论了如何对实验中所获得的数据进行解析和归类的方法。

1.微孔板技术在高通量筛选中的价值

使用者利用一个 marker或者是标记物受光激发后，通过一台普通的微孔板阅读器，就可以监测生化和生物反应进程。常用的读取模式包括检测吸收光，荧光强度(FI)，荧光偏振（FP），时间分辨荧光（TRF）。一般没有方法能够包含所有可能的分析模式，如果达到这样的高分析程度，需要一个配套的方法能够覆盖尽可能宽的实验范围。尽管如此，，还是会有一种方法被优选选择，通过它能够得到更可靠的数据，更高端的信息，以及迅速的读取数据。

荧光寿命被定义成荧光分析在回到基态之前驻留在激发态的时间。荧光寿命对荧光标记物周围的微环境高度敏感。当标记一个反应对，由于化学反应改变这个反应对的状态（例如在酶反应体系中）或者是发生了与其他结合伴侣的结合（例如受体 -配体的结合），将影响到上面所提到的微环境。

无论如何，检测荧光寿命将直接指示反应环境。这类信号要远远强于通常会影响其它探测方法的干扰信号，因此它将为市场需求加入巨大的推动力。

Tecan Ultran Evolution detection platform已经融入了对荧光寿命的检测。除了已经发展的各种检测方法以外，这项新技术使得Ultran Evolution技术平台具有更强的市场应用前景。

2.荧光寿命测定的原理

用 Ultra Evolution测定荧光寿命采用的一种方法，称作时间关联的单光子计数（TCSPC）。

一个脉冲激光器重复激发样品。调节激发脉冲的强度，使得对于任何一个脉冲，在探测器上只有一个光子被计数。按照测量的激光脉冲和探测器感应之间的这段时间，将计数值引入已用荧光计数和时间绘制的柱状图。这个基本实验的千万分之一的重复的数据积分会产生一个平滑的曲线，它代表的就是一条荧光衰减曲线。为了确保单光子计数模式，实验中采用的计数速率相当于激发速率的 1%。ULTRA Evolution的光源的激发速率为25到100纳秒产生一次脉冲，从而使得使用者在不到一秒中能够在探测器上收集到1千万个重复计数。

一个相关的参数值被称作衰减曲线的动态范围，将它定义成最大计数与背景值的比值。使用 Ultra Evolution reader，能够得到跨度大约三个数量级的衰减曲线。动态范围越大，最后得到的信号越准确。

这个过程的时间范围大约是纳秒级的，它比通常的测定时间要快一百万倍。因此，在荧光寿命检测和标准检测模式之间的最主要的技术差别，是它避免了时间平均化。 Whilst FI，FP等，需要通过一段长时间的时间检测对信号累计积分，荧光寿命分解了这些过程，因此用它可以对分子进行动态观测。这个法则被称作"时间显微术"。

3. 荧光寿命数据还原的原则

将荧光强度，荧光偏振，和荧光寿命检测对比后，最显著的差别是数据量。前两项技术，每个孔中产生了 1到2个数值，而在荧光寿命检测模式中，原初数据是一条至少2000个点构成的曲线，反应了样品的复杂化学状态。在荧光强度检测中，只能得到简单的一个值-RFU，在荧光偏振检测模式中，则是两个值的均一化结果。

4．荧光寿命产生的"信号"对应的就是曲线的形状

那么如何描述一个衰减曲线的形状呢？这要依据曲线本身。特征越少，越容易描述。对一条曲线的描述的目的首先是从中获得一个能够反应样品化学状态的数值，其二是通过对分子物态的实时观察得到关于样品的尽可能多的信息。一条单阶的衰减曲线的形状很容易用一个单一的参数定义，该参数即为单阶的时间寿命。而在一个复对数的曲线上，时间寿命则等同于曲线斜率的导数。

对于具有不同的时间寿命的物质所构成的一个样品所衍生的衰减曲线，则需要更复杂的描述。

描述二阶模式的二阶衰减曲线的一个方法，是产生四个参数，两个时间寿命 (τ 1 ，τ 2 )和对应的两个振幅（α 1 ，α 2 ）（见图3）。只有将四个参数综合后，才能比较准确的定义曲线的形状。因此，通过这四个参数，利用公式< τ > = (α 1 τ 1 τ 1 + α 2 τ 2 τ 2 ) / (α 1 τ 1 + α 2 τ 2 ) 可以得到一个值，将其定义为平均时间寿命。平均时间寿命类似用单阶曲线归一化相同数据得到的荧光寿命的值。

例如，两个发色团的混合物，每一个都有自己特有的时间寿命。既然这样，就假定时间寿命τ 1 ， τ 2 已知，那么相对振幅 α 1 /( α 1 + α 2 ) 和 α 2 / ( α 1 + α 2 ) 就分别等同于两种标记物的量。显而易见，在分析检测中，就信号本身而言，包含的信息很少，将这些信号归类后，就可以用以监测复杂的化学反应。

在荧光强度检测（ FI）模式中，荧光信号会随着酶与底物的反应量而改变。在荧光偏振检测中，信号的改变主要是由于分子的大小变化导致的，例如，由于受体和配体结合反应。

而对于荧光寿命检测，衰减曲线的形状则是随着标记物的微环境的变化发生改变。在荧光寿命检测分析技术的发展中，为了监测曲线的形状，需获得一个参数范围。这个信号或许是个单阶荧光寿命曲线，或许等同于二阶曲线得到的时间寿命的一阶值，也可能是反应复合物变化的相对振幅或者是平均时间寿命的值。

除了亦今所能描述的单一信息，从每一条衰减曲线中，可以计算一个综合的数值，该值与在标准的荧光强度测量模式中获得的荧光强度成正比。将这个综合参数与时间寿命分解后的参数组合，将得以能够提供一个样品全部有用的信息。

5. 结论

药物筛选的趋势是朝着获得高质量的数据方面发展的，而数据的质量主要指的是它的可靠性，重复性，以及灵敏性。而且，需要将每个孔的多个相关参数组合，这称作高通量筛选。

荧光寿命是一项新的技术，利用它使得研究和筛选工作有望达到高通量的目标。通过直接检测感兴趣的化学反应中微环境的变化，得到的信号要高于通常检测中信号干扰。

一个荧光寿命检测中得到的原始数据使得能够同时瞬间分析样品的状态。例如，将平均时间寿命和荧光强度值组合处理，将为一些量控信息提供可靠的数据保证。因此，已将荧光寿命时间分辨技术当作一个高通亮筛选的方法。

从技术角度上说，这项新的技术需要借助具有 TCSPC分析能力的仪器。Tecan Ultran Evolution with FLT 会提供给使用者一个友好的界面来评测时间寿命。而真正准确的检测到荧光寿命永远是不容易的。