15 种常用细胞染色试剂及方法

一、细胞染色常用方法

细胞染色常用方法主要包括以下几个：

1、简单染色法，常用碱性染料如美蓝等进行简单染色;

2、革兰氏染色法，主要包括结晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脱色以及番红复染四个过程;

3、瑞氏染色法，瑞氏染料溶剂主要是由伊红美蓝组成;

4、吉姆萨染色法，吉姆萨染色原理与结果和瑞特染色法基本相同;

5、细胞免疫荧光染色法，免疫荧光染色的主要原理是利用抗原 抗体之间的特异性结合。

二、十五种细胞染色试剂

1、 酸性品红(Acid fuchsin)酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容於水，略溶於酒精(0.3%)。

是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。它跟甲基绿同染，能显示线粒体 。组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。

2、 刚果红(Congo red)刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶於水喝酒精，遇酸呈蓝色。

它能作染料，也用作指示剂。它在植物 制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由於它能溶於水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速。

3、甲基蓝(Methyl blue)甲基蓝是弱酸性染料，能溶於水和酒精。

甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。它跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用它染色后不能长久保存。

4、固绿(Fast green)固绿是酸性染料，能溶於水(溶解度为 4%)和酒精(溶解度为 9%)。

固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物 组织上应用极广。它和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。

5、苯胺蓝 (Aniline blue) 是一种混合酸性染料，平常所用很难有一定的标准。

此染料一般很难溶於水，也不易溶於酒精(1.5%)。植物制片中可与番红合用，作为组织染色;也可作藻类植物染色。因为这种染料的成分很不一致，染色效果不易掌握。

6、苏丹Ⅲ (Sudan Ⅲ)苏丹Ⅲ是弱酸性染料，不溶解於水，呈红色粉末状，易溶於脂肪和酒精(溶解度为0.15%)。常用70%酒精中的饱和溶液。苏丹Ⅲ是脂肪染色剂。

7、苏丹Ⅳ (Sudan Ⅳ)苏丹Ⅳ是弱酸性染料，也是很好的染脂肪染料，现在多用以代替苏丹Ⅲ，可染树脂、乳汁管、蜡质以及角质等结构，也可使叶绿体染成暗红色。

8、伊红 (Eosin) 这类染料种类很多。常用的伊红 Y，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶於水 ( 15摄氏度是溶解度达 44%) 和酒精 (溶於无水酒精的溶解度为2%) 。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。

9、碱性品 (复) 红 (Basic fuchsin) 碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶於水(溶解度 1%)和酒精(溶解度 8%)。

碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在尔根氏回应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。

10、 结晶紫 (Crystal violet) 结晶紫是碱性染料，能溶於水 (溶解度 9%) 和酒精 (溶解度 8.75%) 。结晶紫在细胞学、组织学和细菌学等方面应用极广，是一种优良的染色剂。

它是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久储存。

11、龙胆紫 (Gentian violet) 龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互相替用。医药上用的紫药水，主要成分是甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫

12、 中性红 (Neutral red) 中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶於水 (溶解度 4%) 和酒精 (溶解度 1.8%)。

它的碱性溶液中呈现黄色，在强碱性溶液中呈蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色，所以能用作指示剂。中性红无毒，常做活体染色的染料，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。陈久的中性红水溶液，用作显示尼尔体的常用染料。

13、番红 (Safranin) 番红是碱性染料，能溶於水和酒精。

番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料，能染细胞核、染色体和植物蛋白质，示维管束植物木质化、木栓化和角质化的组织，还能染孢子囊。

14、亚甲蓝或美蓝(Methylene blue)亚甲蓝或美蓝是碱性染料，呈蓝色粉末状。

能溶於水(溶解度 9.5%)和酒精(溶解度 6%)。亚甲蓝是动物学和细胞学染色上十分重要的细胞核染料，其优点是染色不会过深。

15、甲基绿 (methyl green) 甲基绿是碱性染料。它是绿色粉末状，能溶於水(溶解度 8%)和酒精(溶解度 3%)。

甲基绿是最有价值的细胞和染色剂，细胞学上常用来染染色质，跟酸性品红一起可作植物木质部的染色。

三、细胞染色具体方法

1、消化收集细胞，以 2-10×10³ cell/coverslip 接种细胞于 24 孔板中，滴加细胞悬液 50-100 µl，2 小时后补加10% FBS+DMEM 500µl。

2、 37℃ 细胞培养箱中培养 48 小时后，显微镜下观察，取细胞状态和细胞数量适应的玻片做染色。

3、 去掉旧培养液，用冰冷的 PBS 洗两次，加 3.7-4% 甲醛 0.5ml(in PBS) 室温固定 10min。

4、 PBS 洗两次，加穿膜液 0.5ml (0.1%triton X-100+0.1M Gycine) 冰上 30min。

5、 PBS 洗两次，加 5mg/ml BSA 0.3ml 室温封闭1小时。

6、 PBS 洗两次，取一张封口膜，做好标记，加一抗( 用 5mg/ml BSA 稀释 1：50-100)25µl于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在湿盒中室温孵育 1-3 小时。

将盖玻片从封口膜上小心夹起，细胞面朝上放入原来的 24 孔板中，PBS 洗两次，取另外一张封口膜，做好标记，加二抗(羊抗兔罗丹明，用5mg/ml BSA稀释1：50-100)25µl 于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一{二}抗液滴上，放在湿盒中室温黑暗中孵育 1-3 小时。

7、 同上 PBS 洗两次，同上操作，将玻片与 10µl DAPI (1µg/ml in PBS，贮存液：1mg/ml in dd H2O) 室温孵育 1-5min。

8、 PBS 洗三次，将玻片背面的水分擦干，封片于载玻片上，做好标记(时间，细胞名称，实验内容，号码)。

9、 待封片胶干后可在荧光显微镜下观察，观察时注意记录每张玻片的内容以免混淆，观察完后将玻片放 -20℃ 保存。

10、若只观察转染了 EYFP 的荧光蛋白，不需要给内源蛋白染色，可直接用 DAPI 染核后封片。

11、 以 BSA (5mg/ml)代替一抗，二抗照加为染色的对照组，做法同上。为了保证实验有重复性，每次做平行 2 组以上。

四、盖玻片的处理

1、 10×10 的盖玻片用医用酒精浸泡过夜(若玻片较脏，可浸泡酸液过夜，用自来水冲洗十几遍后用双蒸水冲三四遍，晾干，用酒精泡过夜，以下步骤同)。

2、 将酒精倒掉,晾干。

3、 准备干净塑料 15ml 离心管，用蒸馏水稀释多聚赖氨酸 1：10 后室温浸泡盖玻片 5min (如果室温小于 15℃ 时延长至 10min ),捞出后于工作台晾干后，密封后可保存半年以上。

4、 上述稀释液可反复浸泡，一般每瓶多聚赖氨酸可够 100-200 张玻片使用，稀释液保存于 4℃，三个月内仍可使用。

DAPI（4，6-联脒-2-苯基吲哚）是一种荧光染料，主要用于检测细胞凋亡，DAPI 可以穿过细胞膜结合 DNA 产生比自身强 20 倍的荧光信号，经过染色后可以利用流式细胞仪观察 DAPI 标记的细胞。