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补体旁路途径溶血活性的测定(ACH50)

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9442

1、原理

兔红细胞不经致敏可激活人补体旁路途径,导致兔红细胞溶解。在反应系统中加入乙二醇双氨基四乙酸(ethyleneglycol-bis-aminotetracetate,EGTA)可和血浆Ca2+螯合,EGTA与Mg2+结合能力很弱,故经典途径被封闭。根据兔红细胞的溶血程度,可测定补体旁路途径的总补体活性。

2、所需主要试剂

(1)兔红细胞(rabbitredbloodcell,RRBC)悬液的制备 无菌采兔耳静脉或心脏血,用阿氏液抗凝,分装,4℃保存。可用1周左右。试验时取一定量的RRBC,用EGTA-GVD2应用缓冲液洗涤3次,并用该缓冲液配制成3×108个/mL细胞悬液;

(2)0.1mol/LEGTA-M溶液 EGTA 38.00g,MgCh·6f102 0.30g,NaOH约7.00g,溶于蒸馏水中,以1mol/LNaOH调节至pH7.5,加蒸馏水至1000mL;

(3)0.03mol/LEGTA-GVB2 0.1mol/LEGTA-M 300ral,0.1mol/LCaCl2 5mL,巴比妥缓冲液(5X,NaCl 85g,巴比妥酸5.75g,巴比妥钠3.75g,蒸馏水1500mL)180mL,2%明胶50mL,加蒸馏水至几,调节至pH7.5;

(4)0.1mol/L乙二胺四乙酸三钠原液(EDTA-Na3) EDTA-Na3 37.23g,NaOH 4.00g。分别将EDTA-Na3溶于500mL蒸馏水中,NaOH溶于100mL蒸馏水中,将NaOH溶液加入EDTA-Na3溶液中混合,用1mol/LNaOH调节至pH7.5,加蒸馏水至1L;

(5)0.01mol/LEGTA-GVB2应用缓冲液 巴比妥缓冲液原液(5X)360mL,0.1mol/LEDTA-Na3原液200ral,2%明胶溶液l00mL,蒸馏水加至2L。

3、方法

在各试管中加人反应物,37℃水浴40min后,加入应用缓冲液6.3mL,3000r/rain离心10rain,取上清,在分光光度计上读取OD452nm值,然后计算每毫升血清样本ACH50单位。

正常值为18.9±2.2(X±1SD)U/ml。

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