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冷冻组织切片上的荧光免疫检验

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一、材料与试剂

1. 第一抗体

2. 第二抗体(Invitrogen)

3. 100%冰冷丙酮

4. 马血清(SantaCruz;sc-2483)

5. Hoechst 33342荧光染料(Invitrogen;H1399)

6. ProLong Gold抗褪色试剂(Invitrogen;P36934)

7. 免疫组化笔(Sigma;Z377821)

8. 指甲油(FisherScientific;50-949-071)

9. PBS

10. 甲醛

11. 甲醇

12. TritonX-100

二、仪器

1. -20°C冰箱

2. 湿盒

三、步骤

1. 从冷藏室取出7 μm 的冻干切片并立刻放入冰冷的丙酮中浸泡10分钟。注,可选的固定条件依赖于所使用的抗原及一抗。常用的固定剂有甲醛、丙酮及甲醇。

2. 用PBS洗涤载片后吸干组织周围的水份,使载片干燥。小心地用PAP笔绕组织圈出轮廓。

3. 将切片用含有0.05%TitonX-100的PBS混合10%的马血清溶液在室温下封闭1小时。

4. 吸干封闭缓冲液,切片放入湿盒中与含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%马血清溶液稀释的第一抗室温体孵育1小时。用足量的抗体溶液完全浸没切片,约150微升。提示,按照推荐方法稀释抗体。

5. 吸去第一抗体并用150 μl 的PBS/TritonX-100缓冲液洗涤5次。

6. 切片在湿盒中与相应的第二荧光抗体AlexaFluor488/555antibody(MolecularProbes)室温孵育1小时。二抗用含有0.05%TritonX-100的PBS配制的2%马血清溶液稀释,比例为1:300,用足够量的二抗溶液(约150 μl)以完全浸没切片。

7. 吸去二抗并用150 μl 的PBS/TritonX-100缓冲液洗涤2次。

8. 用150 μl 的PBS缓冲液洗涤切片3次。

9. 将切片与Hoechst 33342核染料[2 mg/ml 溶于PBS中]孵育2分钟。

10. 吸去二抗并用150 μl 的PBS缓冲液洗涤3次。

11. 让切片干后,每个切片中加约2滴的ProLongGold抗褪色试剂,盖上盖玻片。注意,要小心避免太过滑动盖玻片而损坏组织,不要造成气泡。吸去多余的试剂。

12. 避光放置在室温下几个小时或过液让切片干燥。一旦载片完全变干,用干净的指甲油封住盖玻片的边沿。封片可以避光存放于-20°C几周时间。

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