“黑胶虫”问题

丁香园网友ronghong_2000的观点：

我们实验室最近一次的情况:

我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。

同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。

后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。

可以发现如下的特点：

（1）与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则 多；

（2）对抗生素无效；

（3）可能通过培养箱空气进行污染；

（4）单用培养液及血清培养没发现问题。

（5）换掖冲洗后也无效。

以下是论坛里我找来的相关帖子内容：

“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。

“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候， 细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。

目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题

关于是什么的问题的讨论：

A.玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）

B.据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法

C.据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。

D.有人说是纳米级的细菌

其他的特点：

（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，

（2）在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。

（3）细胞内好像也有存在，

（4）但并不引起培养液混浊

（5）时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡

大家的处理：

1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。

2.如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。

3.换用进口的一次性塑料培养瓶。

4.建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏，。

5.在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。

6.有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。

丁香园网友emilymu825的观点：

我觉得对于黑胶虫的定义非常需要规范化。我对这种东西持保留态度，一是我自己还没有遇到过，二是我们的的确确还不知道这种所谓的“微生物”本质是什么东西。也就因为界定的模糊，现在有很多同行遇到问题很容易就往“黑胶虫”上归咎，其实很有可能只是细胞状态不好时漂点碎片，包括支原体污染导致的，或者血清灭活时间长了出沉淀之类，可一旦归咎于“黑胶虫”，就好像名正言顺的成了“不可抗力”：反正我也不知道是怎么回事，姑且就当是“黑胶虫”吧。可能进来的同行看到这里砖头已经举到半空了，但我认为这问题是确实存在的，需要大家重视。除了上面几位令人尊敬的积极做实验证实的同行们，进这贴的人可能有很多都是细胞不明原因的状态不好，进来看看能不能靠上“黑胶虫”的边的。

我们是做科学的，而现在“黑胶虫”已经快成了我们科研中的迷信，请慎重讨论“黑胶虫”，不要轻易用一个不知道是什么的东西来试图解释手中的现象，希望你相信自己的困惑是可以用我们目前已知的原因解释并且可以解决的，认真寻找原因才是正道。

丁香园网友woniudetiankong：

在别处看到的，转载来，大家看看：

有人认为是“黑胶虫”，也有人认为是支原体，还有些专家更倾向于是非微生物，系血清中的杂质。下面就我所知道的谈谈两者的情况和对付方案把：

“黑胶虫”

胶虫成熟后呈线状,可以快速移动。而且形态是椭圆形，作不规则布朗运动。如果血清从-20取出后在室温下融化就易出现“黑胶虫”，建议血清在4度融化。加入双抗后好像能够抑制生长（具体原因不明，抗生素应该对细菌起作用）。

建议：

一、停止复苏，停止养细胞，彻底消毒所有用于细胞培养的一切用品，包括所用的培养瓶，培养基，吸管，胰酶，孵箱，超净台、空间等等你能想到的和细胞培养相关的所有物品。一个星期后，再复苏污染之前冻存的细胞，注意你的白大衣衣袖污染即可。这样你可能觉得动作太大，但可以用一个星期的时间挽救两个月的时间，还有其他你为了找到污染源，去除污染所耗费的精力，和财力。

二、如用伯氨奎、磺胺、四环素、贝尼尔，也有建议庆大霉素500ug/ml洗涤。如果细胞非常珍贵，可以用PBS多洗几次，培养基内加浓度高些的抗生素，勤换液，勤观察。

三、所有东西最好重配；如果实在要抢救，重点突破，留几瓶污染不是很严重的细胞抢救，其余弃去．

四、另外尽量用质量好的血清，当然最好是进口胎牛血清（国产血清太脏），就是价格高的离谱，经济条件不允许，可以用进口新生牛血清代替。建议如果使用的是Hyclone或GIBCO的血清可不必灭活，这样可以有效减少“小黑点”的形成。

支原体污染

由于口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。

去除支原体污染：

1.抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）

2.Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine

3.Anti-sera

预防与控制方面可从以下各点加强注意：

a)设备方面：

1.使用已作支原体测试ok的细胞株

2.于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染的细胞

3.使用不添加抗生素的培养基培养细胞

b)检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。

c)实验操作人员的无菌观念与无菌操作技术的要求