琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶及血清LDH总活力的测定

一、目的：

1.学习琼脂糖聚胶电泳的原理和方法；

2.学习酶专一性染色原理及其应用；

3.掌握分离LDH同工酶的方法；

4.学习测定血清LDH总活力的原理与方法。

二、原理：

能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同工酶。同工酶的蛋白结构既然有差别，它们的理化性质也就有所差异。因此可用电泳或其他方法将它们分离开来。例如乳酸脱氢酶（LDH）同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸，但经电泳法分离后，就有5个同工酶区带。

由于同工酶在不同组织、器官中的分布不同，即具有组织器官特异性。因此已利用同工酶的酶谱作临床诊断的依据，也被利用于生物分类及遗传育种等工作中。

本实验是用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱氢酶五个同工酶（LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5）。血清乳酸脱氢酶的辅酶是NAD 。当它催化乳酸脱氢时，NAD 即被还原成NADH·H 。

如果还有氧化型吩嗪二甲酯硫酸盐（N-methyl-phen-azo-nium-metho sulfate，简称PMS）和硝基蓝四唑（氮蓝四唑nitroblue tetrazolium，简称NBT）存在，则发生如下反应：

当LDH同工酶区带在琼脂糖凝胶板上分开后，给予NAD 、底物（乳酸）、PMS和NBT，同工酶区带即呈蓝紫色。乳酸脱氢酶在辅酶I的递氢作用下，使乳酸脱氢而生成丙酮酸。

LDH分子量约14万。草酸、乙二胺四乙酸对本酶有抑制作用，所以血浆不适宜测定乳酸脱氢酶活力。此外，硼酸、汞离子、对氯汞苯甲酸以及过量的丙酮酸、乳酸也有抑制作用。

乳酸脱氢酶催化反应是碳水化合物代谢中无氧糖酵解的最终反应，广泛存在于人体各种组织中，按新鲜重量计算，乳酸脱氢酶活力依下列顺序降低：肾脏＞心肌、骨胳肌＞胰＞脾＞肝＞肺。血清中含量很低，红细胞中含量较血清约高100倍，故测定时应避免溶血。如不能及时测定，血清应及早和血块分离，避免红细胞中乳酸脱氢酶逸入血清中。

乳酸脱氢酶测定的方法很多，根据酶作用的反应可分为二大类：一类利用顺向反应以乳酸为基质；另一类利用逆向反应，以丙酮酸为基质。根据测定方法不同又可分为紫外分光光度法和可见分光光度法。紫外分光光度法需用紫外分光光度计测定反应中辅酶I量的变化。可见分光光度法利用2，4—二硝基苯肼和丙酮酸作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕色。目前较多使用以乳酸为基质的方法，此法所需的氧化型辅酶I较稳定，不似以丙酮酸为基质的方法需用的还原型辅酶I很不稳定（在-20℃也不能长期保存）。氧化型辅酶I价格也较低。此外，乳酸钠基质液也比丙酮酸基质稳定，室温中可放1个月。

近来有人利用顺向反应形成的还原型辅酶I可以还原某些染料如2，6—二氯酚-吲哚酚（2，6-dichlorophenol-indophenol）、氯化2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四唑（INT）建立了另外一种类型呈色反应，并以吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）或黄递酶（diapho-rase）作为还原型辅酶I和染料之间的递氢体。此法快速，操作简单，重复性较好。乳酸脱氢酶同工酶显色一般也多利用此类还原四唑蓝方法。

三、器材及试剂：

1.器材：

①巴比妥-HCl缓冲液（pH8.4，0.1mol·L-1）：溶17.0g巴比妥钠于600ml水，加入1mol·L-1 HCl溶液23.5ml，再加蒸馏水至1000ml。

②0.5mol·L-1乳酸钠溶液：称取5.6g乳酸钠，溶于蒸馏水并稀释至100ml。

③0.001mol·L-1 EDTA·2Na（乙二胺四乙酸钠盐）溶液：称取EDTA·2Na·H2O372mg，溶于蒸馏水并稀释至100ml。

④0.5%琼脂糖凝胶：溶50mg琼脂糖于5ml巴比妥-HCl缓冲液（pH8.4，0.1mol/L），加蒸馏水5ml，待琼脂糖溶化后，再加0.001mol·L-1 EDTA·2Na溶液0.2ml，冰箱保存备用。

⑤0.8—0.9%琼脂糖染色胶：溶80—90mg琼脂糖于5ml巴比妥- HCl缓冲液（pH8.4，0.1mol·L-1），加蒸馏水5ml，待琼脂糖溶化后，再加0.001mol/L EDTA·Na2溶液0.2ml，冰箱保存备用。

⑥显色液：现用现配。溶50mgNBT(硝基蓝四唑)于20ml蒸馏水（25ml棕色容量瓶），溶解后，加入NAD125mg及PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐）12.5mg，再加蒸馏水至25ml。该溶液应避光低温保存，一周内有效。如溶液呈绿色，即失效。

⑦2%醋酸缓冲液：2ml醋酸（99.5%）加蒸馏水98ml。

⑧电泳用缓冲液（pH8.6，0.075mol·L-1）；巴比妥钠15.45g、巴比妥2.76g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。

⑨0.1mol·L-1甘氨酸溶液：称取甘氨酸7.505g，氯化钠5.85g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml。

⑩乳酸钠缓冲基质液(pH10.0)：在乳酸钠溶液（65~70%）10ml中加入0.1mol·L-1甘氨酸溶液125ml、0.1mol·L-1氢氧化钠75ml，混和。

四、操作步骤：

（一）琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶。

1.琼脂糖凝胶板的制备和电泳：将0.5%琼脂糖凝胶水浴加温熔化。取2ml熔化的凝胶液平浇于一洁净的载玻片上（载玻片放在水平台上，载玻片的大小为7.5×2.5cm）。

在凝胶半凝固时，用一小铁棒在1/3处放下，待胶凝固后，用磁铁吸出小铁棒，用滤纸片仔细吸去小槽内液体，此小槽为点样槽（图18-1）

用微量注射器向小槽内加入新鲜血清15—20μl。将凝胶板放在电泳槽内，两端各以浸有电泳缓冲液的滤纸或纱布作盐桥，点样端靠近阴极。电泳40—60分钟，电压约100伏。

2.显色：约于电泳终止前10分钟，将0.8—0.9%琼脂糖染色胶在水浴中熔化。取此熔化的凝胶0.67ml与显色液0.53ml及0.5mol·L-1乳酸钠溶液0.2ml混匀，立即浇在电泳完毕的凝胶板上，37℃避光保温1小时，即显示出五条深浅不等的蓝紫色区带。最靠近阳极端的区带是LDH1，依次为LDH2、LDH3和LDH4，LDH5则移向阴极端。

3.固定与干燥：将显色后的凝胶板浸于2%醋酸溶液中，2小时后取出，用一干净滤纸覆盖凝胶板上，50℃烘1.5—2小时，烘干后，取下滤纸，背景即透明。

如需定量，可用凝胶成像分析系统或光密度计测定各区带。

（二）LDH活力测定

1.标准曲线绘制见表18-1。

单位定义 以标本100ml即100ml原血清在37℃作用15分钟产生丙酮酸分子1个微摩尔为1个单位。

五、结果与讨论：

1.用凝胶成像系统对LDH同工酶各组分进行定量。

2.计算出血清LDH总活力：

①绘制出标准曲线

②按下述公式计算LDH总活力

3.总结出来实验中电泳分离LDH操作的关键步骤。

4.写出酶活力测定中的注意事项。