植物基因克隆的策略与方法

基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等，1995;舒群芳等，1997)，为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法，本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。

1　功能克隆(functional Cloning)

功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息，在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis，1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行，(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因，(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略，很多基因的分离利用这种策略。

Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2)，葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在，可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性，在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶，因此克隆该基因经过转基因后，对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hain等，1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等，1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库，分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等，1996)。

植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质，它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化，使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV)，并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等，1989)。王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒(potato virus X， pvx)，克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因，并将外壳蛋白基因转入马铃薯中，以期获得抗pvx病毒的栽培种马铃薯(王春香等，1991)。病毒外壳蛋白(Coat protein cp)基因的成功克隆，可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介导的抗性。Van kan 报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9，可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物(Van Kan等，1991)。

我们1995年构建了天麻cDNA文库，制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆，为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等，1995;舒群芳等，1997)。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、虽然某一性状的编码基因是未知的。如果对其生理生化及代谢途径研究的比较清楚，就可以分离和纯化控制该性状的蛋白质。因此功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质。只要有一个纯的蛋白质，得到十分特异的探针，这一策略是行之有效的。采用功能克隆方法虽然已经克隆了很多基因，但由于绝大多数基因的产物目前还不知道。所以大多数基因难以用这一经典的方法来克隆。随着分子生物学技术的发展，一条新的基因克隆策略逐渐形成，这就是定位克隆。

2　定位克隆(Positional cloning)

根据遗传连锁分析，染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因，研究该基因的功能或抗性的生化机制，这样一种策略叫定位克隆(Monaco，1994)。连锁分析即通过基因与DNA标记之间的重组系数来估计这两者之间的距离，若某种性状的基因与DNA标记在子代不分离，即有连锁在一起的趋势。根据这一原理可将与已知的某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位。由于连锁分析需要依赖特定的基因作为连锁标记，即标记基因与待研基因之间存在连锁关系，而满足与待研基因相连锁的基因实在太少，所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难。RFLP的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内，解决了连锁分析中难以克服的困难。

1980年Wyman等科学家首次建立了限制酶切片段长度多态性RFLP (restriction fragment length polymorphism)，使对任何一种表型相关的基因的定位成为可能。限制酶切片段长度多态性是用限制性内切酶切割后产生的DNA片段长度的多态性呈孟德尔式遗传，是存在于全基因组的独特的多态标记，RFLP使基因定位变得易行(Wyman等，1980)。目前定位克隆一般是用RFLP等分子标记制作遗传图谱，寻找与待测基因连锁的RFLP标记，获得基因在染色体上的定位然后克隆基因。所以RFLP和后来发展起来的RAPD技术的建立，可将待测基因相对准确地定位，利用已知的基因可分离与之连锁的未知基因。

其基本程序是构建一个基因组文库、用已知的A基因为探针，从基因组文库中筛选出与其有同源序列的a克隆，再用a克隆为探针从基因组文库中筛选出与a克隆有同源序列的b克隆，然后以此类推最后筛选出未知基因并把它分离出来。目前已在番茄、烟草、大麦、水稻、大豆、玉米等植物中发现了与抗病基因紧密连锁的RFLP标记并构建了遗传图谱(Figdore等，1988;Heun等，1991;Smith，1991;Diers等，1992)。用这种方法已分别克隆到拟南芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因(Martin等，1993;Bent等，1994;Mindrinos等，1994;Wenyuan等，1995) 。Martin等1993年最早用定位克隆技术克隆出番茄pto基因，pto基因负责对带有无毒基因Avrpto的细菌，丁香假单胞菌(pseudomonas syringae pv)菌株的抗性，Pto基因导入感病番茄后转基因植株增强了对病原菌的抗性(Martin等，1993)。Wenyuan等1995年用这一技术克隆了水稻Xa21基因，Xa21基因对真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)具有抗性(Wenyuan等，1995)。

3　转座子标记法(transposon tagging)

转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段。在转座过程中原来位置的DNA片段(转座子)并未消失，发生转移的只是转座子的拷贝、基因发生转座可引起插入突变使插入位置的基因失活并诱导产生突变型或在插入位置上出现新的编码基因。通过转座子上的标记基因(如抗药性等)就可检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。转座子标记法是把转座子作为基因定位的标记和通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因(Fedoroff等，1984;Jones等，1994)。

利用转座子克隆植物基因的操作步骤主要应是以下几方面:(1) 把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体。(2) 把转座子导入目标植物。(3) 利用Southern杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中，这是转座子定位和分离目标基因所不可缺少的。(4) 转座子插入突变的鉴定及其分离(Ellis等，1992)。通常用于克隆植物基因的转座子有玉米的Ac. Mu， Smp和Ds等。Ac含有编码转座酶的基因，能够自主的转座，Ds不含转座酶所以不能自主的转座，但Ds-Ac系统因Ac为Ds提供了转座酶就可以自主的转座了。用转座子标记法进行植物基因的分离，首要的是把Ac等转座子转化到要进行基因克隆的植物中，目前多数是利用土壤农杆菌介导的转化系统把转座子导入目标植物中(Keller等，1993;Bancroft等，1993)。

目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物中克隆出抗性基因(Johal和Briggs，1992;Whitham等，1994;Jones等，1994;Gregory等，1995)。Johal和Brigge分离出抗灰色长蠕孢(Helminth osporium carbonum)1号小种玉米的HMI特异真菌抗性基因。该基因存在于玉米的抗性品种中，能够分解长蠕孢1号小种产生的对玉米具特异致病性的HC毒素，该基因编码HC毒素脱毒酶可使植物具有抗病性(Johal和Briggs，1992)。和转座子标记法的原理相似的还有T-DNA标记法，两者都是由于一段基因的插入导致染色体结构发生变化产生突变体，而T-DNA标记法产生的突变是由于T-DNA插入导致的。Kenneth等利用T-DNA插入标记培育出拟南芥矮化突变体(Kenneth等，1989)。

4　人工合成并克隆基因

蜘蛛毒素是一种小肽，它只有37个氨基酸，体外实验表明它能杀死多种对农作物有害的昆虫，蒋红等1995年根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，采用植物偏爱密码子、人工合成并克隆了此肽的基因(蒋红等，1995)。Adang 1995年人工合成了苏云金杆菌毒蛋白(Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein)基因(Adang等，1995)。

5　表型克隆(phenotype cloning)

1995年Jonsson和Weissman提出表型克隆概念(Jonsson和Weissman，1995)，有些植物目前即不了解它的基因产物，也没有对它们进行基因定位，但已知植物在表型上存在差异，利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。San等用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因(Sun等，1992)。表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来，从而分离特定表型相关基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因(Brown，1994)。

6　mRNA差异显示(mRNA differential display)

1993年Liang和Averboukh等科学家提出了mRNA差异显示(mRNA DD， mRNA differential display)的方案(Liang等，1993)。这一方案的依据是在高等真核生物中所有的生命过程和病理变化，不论是由单基因控制的还是由多基因控制的，最终都是通过基因表达的质或量的差异而体现出来。研究基因表达差异，研究两基因组差异表达基因的分离，为克隆复杂性状相关基因开辟了重要的途径。该方案可以检测、分离出全长任何部分有突变的mRNA，其基本程序是:(1)提取两种细胞的mRNA，反转录后成为2种cDNA。(2) 以一定的引物作随机聚合酶链反应。(3) 通过扩增产物的电泳分析，分离出不同样品间的差异条带。(4)将差异DNA做成探针。(5) 在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析(Baeur等，1993)。Liang和Pardee又建立了mRNA差别显示PCR方法(Liang和Pardee，1992)，该方法可以同时分析几个样品间基因的表达，检测灵敏度高，PCR扩增后，一些表达量很低的mRNA也能被检测出来，应用PCR及DNA测序，两种技术简单易行，目前已被成功地用来分离小麦热激蛋白基因(Joshi等，1996)和水稻蔗糖调节基因(Tseng等，1995)等。

7　减法杂交(Subtractive hybridization)

Lee等1991年提出减法杂交技术(Lee等，1991)，植物在生长发育过程中不同组织或同一组织的不同发育阶段，由于基因特异性的表达，其mRNA表现不同，这样从表达特异基因的组织中提取 mRNA，反转录为cDNA，从无特异基因表达的组织中提取mRNA，两者杂交，在表达特异基因的组织和无特异基因表达的组织中均表达的基因产物形成杂交分子，而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态，把这种单链cDNA分离出来即为差异表达的基因，Chong等用此技术克隆了小麦春化相关基因(Chong等，1994)。

8　PCR扩增克隆

这是一种参考已知基因的序列克隆基因的方法。目前已经知道了很多植物基因的序列，当克隆类似基因时可先从Gene bank库中找到有关基因序列，用PCR方法克隆不同植物的基因。基本方法是根据已知基因的序列设计并合成一对引物，从植物中提取DNA进行PCR扩增，扩增的片段纯化后连接到合适的载体上，用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知基因序列进行比较，如目前已在玉米、水稻、向日葵、巴西豆等植物中分离出富含甲硫氨酸的蛋白及其编码基因，根据Masumura等(1989)发表的10KD水稻醇溶蛋白基因序列合成一对引物，王广立等克隆了水稻10KD醇溶蛋白基因(王广立等，1994)。

9　依据序列同源性克隆基因

生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。此方法的基本作法是在其它种属的同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后以已知的基因序列为探针来筛选目的克隆。马德钦等根据文献报道的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的序列作了菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析(马德钦等，1996)。

综上所述，可见发现和克隆基因的过程是艰巨和富有收获的，几十年来各国科学家在基因克隆这一最激动人心的生物高技术领域内走过了艰难而又曲折的历程，从而创造和发展了上述种种植物基因克隆的方法，使人类在认识自然、掌握自然的道路上又前进了一步。前辈所创造的成就和技术无疑为我们成功地克隆植物基因提供了快捷和高效的途径。利用已知序列克隆基因，用同种或同属的已知的同源序列筛选基因都比较容易，适合于克隆那些研究较晚的许多重要农作物的基因。获得极纯的蛋白质是功能克隆的关键，随着蛋白质纯化技术的提高，功能克隆将发挥它的潜在作用。随着植物遗传图谱上基因定位基础研究工作的提高，定位克隆将发挥其巨大的作用。

作者单位：舒群芳　李文彬　孙勇如(中国科学院遗传研究所　北京　100101)

赵路(首都师范大学化学系　北京　100037)

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