植物基因克隆的策略与方法

基因的克隆就是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展，使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等，1995;舒群芳等，1997)，为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法，本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。

1　功能克隆(functional Cloning)

功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息，在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis，1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行，(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因，(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略，很多基因的分离利用这种策略。

Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2)，葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在，可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性，在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶，因此克隆该基因经过转基因后，对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hain等，1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等，1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库，分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等，1996)。

植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质，它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化，使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV)，并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等，1989)。王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒(potato virus X， pvx)，克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因，并将外壳蛋白基因转入马铃薯中，以期获得抗pvx病毒的栽培种马铃薯(王春香等，1991)。病毒外壳蛋白(Coat protein cp)基因的成功克隆，可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(Coat Protein Mediated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介导的抗性。Van kan 报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9，可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物(Van Kan等，1991)。

我们1995年构建了天麻cDNA文库，制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆，为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等，1995;舒群芳等，1997)。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、虽然某一性状的编码基因是未知的。如果对其生理生化及代谢途径研究的比较清楚，就可以分离和纯化控制该性状的蛋白质。因此功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质。只要有一个纯的蛋白质，得到十分特异的探针，这一策略是行之有效的。采用功能克隆方法虽然已经克隆了很多基因，但由于绝大多数基因的产物目前还不知道。所以大多数基因难以用这一经典的方法来克隆。随着分子生物学技术的发展，一条新的基因克隆策略逐渐形成，这就是定位克隆。

2　定位克隆(Positional cloning)

根据遗传连锁分析，染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因，研究该基因的功能或抗性的生化机制，这样一种策略叫定位克隆(Monaco，1994)。连锁分析即通过基因与DNA标记之间的重组系数来估计这两者之间的距离，若某种性状的基因与DNA标记在子代不分离，即有连锁在一起的趋势。根据这一原理可将与已知的某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位。由于连锁分析需要依赖特定的基因作为连锁标记，即标记基因与待研基因之间存在连锁关系，而满足与待研基因相连锁的基因实在太少，所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难。RFLP的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内，解决了连锁分析中难以克服的困难。

1980年Wyman等科学家首次建立了限制酶切片段长度多态性RFLP (restriction fragment length polymorphism)，使对任何一种表型相关的基因的定位成为可能。限制酶切片段长度多态性是用限制性内切酶切割后产生的DNA片段长度的多态性呈孟德尔式遗传，是存在于全基因组的独特的多态标记，RFLP使基因定位变得易行(Wyman等，1980)。目前定位克隆一般是用RFLP等分子标记制作遗传图谱，寻找与待测基因连锁的RFLP标记，获得基因在染色体上的定位然后克隆基因。所以RFLP和后来发展起来的RAPD技术的建立，可将待测基因相对准确地定位，利用已知的基因可分离与之连锁的未知基因。

其基本程序是构建一个基因组文库、用已知的A基因为探针，从基因组文库中筛选出与其有同源序列的a克隆，再用a克隆为探针从基因组文库中筛选出与a克隆有同源序列的b克隆，然后以此类推最后筛选出未知基因并把它分离出来。目前已在番茄、烟草、大麦、水稻、大豆、玉米等植物中发现了与抗病基因紧密连锁的RFLP标记并构建了遗传图谱(Figdore等，1988;Heun等，1991;Smith，1991;Diers等，1992)。用这种方法已分别克隆到拟南芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因(Martin等，1993;Bent等，1994;Mindrinos等，1994;Wenyuan等，1995) 。Martin等1993年最早用定位克隆技术克隆出番茄pto基因，pto基因负责对带有无毒基因Avrpto的细菌，丁香假单胞菌(pseudomonas syringae pv)菌株的抗性，Pto基因导入感病番茄后转基因植株增强了对病原菌的抗性(Martin等，1993)。Wenyuan等1995年用这一技术克隆了水稻Xa21基因，Xa21基因对真菌Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo)具有抗性(Wenyuan等，1995)。

3　转座子标记法(transposon tagging)

转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段。在转座过程中原来位置的DNA片段(转座子)并未消失，发生转移的只是转座子的拷贝、基因发生转座可引起插入突变使插入位置的基因失活并诱导产生突变型或在插入位置上出现新的编码基因。通过转座子上的标记基因(如抗药性等)就可检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。转座子标记法是把转座子作为基因定位的标记和通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因(Fedoroff等，1984;Jones等，1994)。

利用转座子克隆植物基因的操作步骤主要应是以下几方面:(1) 把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体。(2) 把转座子导入目标植物。(3) 利用Southern杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中，这是转座子定位和分离目标基因所不可缺少的。(4) 转座子插入突变的鉴定及其分离(Ellis等，1992)。通常用于克隆植物基因的转座子有玉米的Ac. Mu， Smp和Ds等。Ac含有编码转座酶的基因，能够自主的转座，Ds不含转座酶所以不能自主的转座，但Ds-Ac系统因Ac为Ds提供了转座酶就可以自主的转座了。用转座子标记法进行植物基因的分离，首要的是把Ac等转座子转化到要进行基因克隆的植物中，目前多数是利用土壤农杆菌介导的转化系统把转座子导入目标植物中(Keller等，1993;Bancroft等，1993)。

目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物中克隆出抗性基因(Johal和Briggs，1992;Whitham等，1994;Jones等，1994;Gregory等，1995)。Johal和Brigge分离出抗灰色长蠕孢(Helminth osporium carbonum)1号小种玉米的HMI特异真菌抗性基因。该基因存在于玉米的抗性品种中，能够分解长蠕孢1号小种产生的对玉米具特异致病性的HC毒素，该基因编码HC毒素脱毒酶可使植物具有抗病性(Johal和Briggs，1992)。和转座子标记法的原理相似的还有T-DNA标记法，两者都是由于一段基因的插入导致染色体结构发生变化产生突变体，而T-DNA标记法产生的突变是由于T-DNA插入导致的。Kenneth等利用T-DNA插入标记培育出拟南芥矮化突变体(Kenneth等，1989)。