人APC和TSC－2 cDNA的长5＇RACE

利用RACE [Rapid Amplification of cDNA ENDs，cDNA末端的快速扩增]，可以很简单地得到mRNA的5＇末端序列，然而5＇RACE是一个很复杂的技术，它的成功依赖每一步反应的有效完成。cDNA第一链的合成是由一个反义的基因特异性引物（Gene－specific primer，GSP）来起始的，cDNA第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）在cDNA的5＇末端加上一个合成的同聚核苷酸锚定序列。利用第二个巢式GSP和一个与同聚核苷酸尾巴可以退火的锚定引物来扩增cDNA的5＇末端。

用SUPERSCRIPTTM II RT从mRNA复制成cDNA 用RNase H和RNase T1降解RNA 用GLASSMAXò Spin Cartridge纯化cDNA 用dCTP和TdT给纯化的cDNA加尾 用精简的锚定引物和巢式GSP2 PCR扩增dC加尾的cDNA 用AUAP和巢式GSP重新扩增初步PCR产物

最初的5＇RACE系统是按照这个方法进行的，它首先利用SUPERSCRIPT™ RNase H RT来合成cDNA第一链，然后利用一个快速、有效的方法分离cDNA，通过一个简单的dC加尾系统来加尾，并使用了一个新颖的锚定引物，该引物带有脱氧次黄嘌呤，可以最大可能的有效、特异地从dC尾巴引发扩增发应。锚定引物设计时还可以选择提供UDG克隆位点，使获得5＇RACE产物很方便。

5＇RACE系统版本2保留了原始的5＇RACE系统基本策略和优点，同时包括下列一些改进：

1）利用无DNase的RNase H和RNase T1的混合物，来去掉制备好的cDNA中的RNA，以防止带有的RNA会抑制TdT加尾效果；

2）简单的5×加尾缓冲液；

3）高度纯化的重组TdT，适合于5＇RACE用。另外，重新设计的扩增引物符合带有古细菌DNA聚合酶（含有3＇到5＇外切核酸酶活性）的长PCR聚合酶混合物的需要。

由于5＇RACE系统的复杂性和单个基因特异性引物的使用（和锚定引物一起），使用Taq DNA聚合酶来扩增5＇末端片段长度受到限制，小于1.0kb。然而，最近PCR技术的进展使得可以PCR扩增的长度超过20kb。这种长PCR技术是基于在原来的热稳定聚合酶上，额外加有一定限量的带有3＇到5＇外切核酸酶活性的DNA聚合酶，原来通常使用的是Taq DNA聚合酶，缺少校正功能。

在这儿我们展示将长PCR技术应用到5＇RACE系统中，来分离5.5kb长的人结节性脑硬化II（tuberous sclerosis II，TSC-2）mRNA和8.9kb长的腺瘤性结肠息肉（adenomatous polyposis coli，APC）mRNA的5＇末端，扩增的5＇末端片段要比单独用Taq DNA聚合酶获得的片段长。

方法

使用5＇RACE系统版本2 （Cat. No. 18374-058）来扩增TSC-2和APC cDNA的5＇末端，利用TRIZOL®试剂，按照使用说明操作来分离HeLa S3细胞的总RNA，并增加用乙酸铵/乙醇来沉淀总RNA。5＇RACE中使用的引物，包括精简的锚定引物（Abridged Anchor Primer，AAP）和精简的通用扩增引物（Abridged Universal Amplification Primer，AUAP），以及TSC-2和APC的GSP如表1所示，引物名字上的数字代表引物3＇碱基在已发表序列中的位置，并在AAP序列的5＇端进行一些调整，所用的引物都由GIBCO BRL合成，脱盐沉淀，用无菌水稀释到10mM。PCR用的试剂，包括Taq DNA聚合酶，PCR SUPERMIX，和ELONGASETM扩增系统都来自Life Technologies（即现在的Invitrogen公司）。ELONGASE™酶混合物包括Taq DNA聚合酶和火球菌GB-D（Pyrococcus species GB-D）聚合酶。如果PCR单独使用Taq DNA聚合酶，5＇RACE系统版本2还带有用于UDG克隆的引物。

表1 引物的序列

引 物	序 列
AAP	GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG
AUAP	GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC
TSC-2-5472	TGT GCA CTG GGG TCA GGA C
TSC-2-2826	CCT TCT CGG GGG TGT CAT CA
TSC-2-2821	TCG GGG GTG TCA TCA AAA GA
TSC-2-2657	GCA GGG AGA TGG CGA ACA
TSC-2-2441	GGC ACA GCG GTG GAT GA
TSC-2-1902	CGC AGC AGC AAC AGG AAG
TSC-2-1732	CCA GGA CGG CTG TCT TCA C
TSC-2-829	CAA GGA GGT TCC GCA TCA G
APC-5846	ATG ACT GGG GAA AAG TGG ATT GT
APC-1797	ATA CGC TTT TGA GGG TTG ATT CC
APC-1632	GTT GGG CCA CAA GTG CTC TC
APC-1242	ACG CCT GCC TCT CTT GTC A

结果和讨论

APC 5＇末端的扩增

8.9kb APC mRNA的5＇末端序列获自由HeLa RNA得到的5.8kb长的cDNA第一链，对初步PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析显示，在所期望的APC 5＇末端位置没有条带（数据没有显示），图2显示巢式PCR分别得到1.6kb和1.2kb长的APC 5＇末端序列，巢式扩增显著地增加了产物产量。

图2 APC 5＇末端的扩增。用对应APC mRNA的位置5846的GSP反转录1mg Hela总RNA得到APC mRNA。cDNA被纯化、加尾，和用对应位置1797（A带）和位置1632（B带）的引物和AAP一起，用ELONGASE酶混合物来扩增（94℃ 30s，接着35个循环的94℃ 15 s，55℃ 30 s，68℃ 5 min）。初步PCR用TE缓冲液稀释100倍，取1ml用引物APC－1632（A带）或引物APC－1242（B带）和AUAP分别重新扩增（30个循环），每个PCR产物取10ml在0.8％琼脂糖上，0.5倍TBE凝胶电泳和溴化乙锭染色

 

TSC-2 5＇末端的扩增

我们通过分离更长的TSC-2 5＇末端来检测5＇RACE的性能，使用2.8kb长的cDNA，利用不同的引物和AAP一起分别进行扩增反应（初步PCR），图3显示2个最大的片段，通过凝胶电泳分析初步PCR产物显示每个反应都得到了很多扩增片段，其中最大的对应着所用引物5＇RACE产物所期望的大小，所期望大小的TSC-2通过用Southern斑点杂交确证（数据没有显示），选定大小的DNA片段用TSC-2特异巢式引物来重新扩增，获得了每个GSP所对应期望大小的特异的DNA片段，当TSC-2初步PCR产物仅仅稀释后（与APC基因一样），用作巢式PCR，得到了更小的全长产物（数据没有显示）。

图3 TSC－2 5＇末端的扩增。用引物TSC－2－2821 GSP反转录1mg Hela总RNA得到TSC－2 mRNA，用引物TSC－2－2657（A带）或引物TSC－2－2441（B带）和AAP一起，用ELONGASE酶混合物以图2方式扩增。初步PCR用琼脂糖电泳分离，选定一定大小的凝胶抽提，并分别用引物TSC－2－2441（A带）或引物TSC－2－1902（B带）和AUAP重新扩增（和上述一样30个循环），每个巢式PCR产物取10µl 在0.8％琼脂糖上，0.5倍TBE凝胶电泳和溴化乙锭染色。

在TSC-2的另外一个实验中，使用了一个对应位置5472的反义引物来合成cDNA第一链，开始的时候，我们使用了几个GSP和锚定引物扩增这个更长的cDNA产物，来得到5＇末端序列，但是没有成功。用各个GSP和5＇末端正义GSP一起，进行RT-PCR，得到了全长cDNA（数据没有显示），用引物5472最后获得成功的一个主要因素是加尾条件，在加尾反应中，加入10％DMSO，作为助溶剂，来完成5＇RACE（图4）。残留的少量DMSO（终浓度为0.2％）不影响PCR。

图4 TSC－2 cDNA的长5＇RACE。初步PCR产物（带1和带3）和巢式PCR产物（带2和带4）的琼脂糖凝胶分析。用5µg Hela总RNA，引物TSC－2－5472，45℃完成cDNA合成，dC加尾反应用了10µl GLASSMAX纯化的cDNA，并包含10％的DMSO，用1µl 加尾反应产物直接PCR扩增[94℃ 30s，接着40个循环的94℃ 15 s，65℃ 20 s，68℃ 5 min]，其中使用了1单位的ELONGASE酶混合物[PCR 50ml终体积，其中60 mM Tris－SO4（pH9.1），18 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，dNTP每个200 µM，引物每个400 nM ]，其中分别是AAP和引物TSC－2－2826（A带）或引物TSC－2－1732（B带）一起使用。每个PCR产物（带1和带3）取10µl 在0.8％琼脂糖上，1倍TAE凝胶电泳和SYBRò绿染色（分子探针），再用Hitachi FM－BioTM荧光成像仪（505－nm滤镜）成像。SYBRò绿和成像仪一起提供低背景，但分辨率和溴化乙锭染色相似的凝胶分析。用于巢式PCR的大小选定的材料来自2.83 kb或1.73 kb的带，分别取5到10µl的凝胶回收，每个回收胶中加50 µl TE缓冲液，65℃培育10分钟来洗脱出DNA，用1µl大小选定的PCR产物进行30个循环的巢式PCR（带2和带4）。

这里应该指出的是可以扩增到的最大的TSC-2 5＇末端片段是2.83kb，其它对应更大片段的引物（在TSC-2中位置5161，5089，和4535）没有能得到特异的5＇RACE产物，甚至使用一系列的巢式PCR引物和锚定引物也没能成功。然而，用5＇RACE巢式扩增相同大小的材料，以两个GSP来进行RT-PCR，可以很容易获得TSC-2特异性PCR产物，说明存在更长片段的TSC-2特异产物。通过5＇RACE获得的产物如此复杂，一个可能的原因是能够用于成功扩增的产物长度有限。由于所有的3＇末端都加了尾，以及异源PCR产物的存在，降低了扩增全长5＇末端产物的效率（图4）。

比较ELONGASE酶混合物和Taq DNA聚合酶 ELONGASE酶混合物能够扩增TSC-2的2.83kb片段，而Taq DNA聚合酶只能扩增到1.73kb片段（图5），对于1.73kb的片段，ELONGASE酶混合物得到的扩增产量明显更多。

图5比较Taq DNA聚合酶和ELONGASE酶混合物。 人TSC－2的长5＇RACE以图4所示来完成，取1µl dC加尾反应产物分别用ELONGASE酶混合物（带2）或1单位的Taq DNA聚合酶（带1）[PCR 50ml终体积，其中20 mM Tris-HCl（pH8.4），50 mM KCl，1.5 mM MgCl2，dNTP每个200 µM，引物每个400 nM ]进行扩增，其中分别是AAP和引物TSC－2－2826（A带）或引物TSC－2－1732（B带）一起使用。

优化5′RACE的TdT加尾条件 发现有几个因素影响cDNA 3′末端加尾效率：1）RNA的存在抑制TdT；2）缓冲液成分和反应条件；3）TdT的数量和纯度；和4）cDNA 3′末端的二级结构。

虽然TdT不能用RNA作为底物，但RNA的存在能够抑制酶活性，在添加0.01mg这么少的RNA，就能够导致加尾寡聚核苷酸数量较少和加上的核苷酸数目减少。用RNase T1在加入TdT前，先处理反应混合物，能够充分地减少RNA的抑制影响。

RNA的抑制影响可以在当5′RACE完成后看到（图6），在加尾反应中RNA数量的增加，结果导致5′RACE扩增产物的减少。在对照反应中，RNA的添加，并不影响用两个基因特异性引物对cDNA的扩增。可以在纯化和加尾前，用RNase H/RNase T1混合物处理cDNA/RNA混合物，来除掉RNA的抑制影响。

图6 RNA对TdT加尾和5＇RACE的影响。A图. RNA对加尾的抑制作用。dC加尾反应液中包含1×10⁷个拷贝的纯化923个碱基的cDNA，显示了用TdT加尾，并根据5＇RACE系统进行扩增的Hela总RNA的数量。B图.用RNase混合物消化带有异源RNA的cDNA提高5＇RACE的效率。样品包含2×10⁶个拷贝的923个碱基的cDNA和1µg Hela总RNA，用RNase H和RNase T1（带1）或不和RNase T1（带2）一起37℃培育30分钟，cDNA样品按照5＇RACE系统版本2所描述的来纯化和扩增，每个PCR产物的十分之一在1.5％琼脂糖上，用0.5倍TBE，带有0.5mµg/ml溴化乙锭凝胶电泳分析。

用于加尾反应的TdT的数量和纯度也是非常重要的，太多的TdT会导致5′RACE产物量很少，另外TdT的不同制备方法，经常包含DNA结合活性和其它污染，这些可能并不影响加尾，但是会影响随后的PCR反应，从而导致5′RACE反应失败。为了减少这种可变性，在5′RACE版本2中使用的TdT是高度纯化的重组牛TdT。

3′末端的双链结构和发卡结构，都会通过减少加尾所需要的3′-OH的有效性，从而可以明显地削弱cDNA的均聚加尾作用。5′RACE手册中在加尾前，带有一个重要的退火程序（94℃，1到2分钟），可以破坏cDNA的二级结构。必需立即放到冰上冷却，并保持反应混合物变冷，直到加入TdT为止，这能够有助于保持3′末端退火。存在cDNA的二级结构的可能性和cDNA长度成正比。在加尾反应中，添加助溶剂DMSO有助于增加cDNA的加尾效率，特别是长cDNA，这种DMSO的作用，推测认为是因为DMSO会破坏DNA的二级结构。重组TdT可以耐受DMSO的浓度高达20％，在这项研究中，5.4kb的TSC-2 cDNA的有效加尾和5′RACE（图4）需要添加10％的DMSO到加尾反应中去，而2.8kb的TSC-2 cDNA（图3）和APC产物（图2）可以很容易加尾和扩增，不需另外添加DMSO。

当在5′RACE中使用DMSO时，应该考虑DMSO对随后的PCR的影响，在这项研究中，用于扩增的少量加尾反应物（50ml PCR体系中加1ml），能够使所用的DNA聚合酶的任何潜在的抑制作用最小化，如果目标cDNA的有效加尾，需要DMSO，加尾的cDNA在扩增前，通过纯化，去掉DMSO，可以消除任何潜在的对PCR抑制作用。

结论

这项研究结果显示了用SUPERSCRIPTTM合成长的cDNA第一链的能力和在cDNA 3′末端加上多聚dC尾巴的有效性。这些数据从总体上指出了长5′RACE的主要障碍是依靠PCR的特异性和有效性。这些对于获得长cDNA 5′末端的重要要求，突出了需要有效引物设计，优化PCR，和包含初步PCR的Southern斑点杂交分析以及用巢式基因特异引物重新扩增选定大小的全长产物的一个系统实验策略。在这项研究中，在5′RACE时，用ELONGASE酶混合物进行PCR，使得扩增产物大于2.5kb，并比一般使用的Taq DNA聚合酶对5′RACE产物扩增更有效。