人APC和TSC－2 cDNA的长5＇RACE

利用RACE [Rapid Amplification of cDNA ENDs，cDNA末端的快速扩增]，可以很简单地得到mRNA的5＇末端序列，然而5＇RACE是一个很复杂的技术，它的成功依赖每一步反应的有效完成。cDNA第一链的合成是由一个反义的基因特异性引物（Gene－specific primer，GSP）来起始的，cDNA第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）在cDNA的5＇末端加上一个合成的同聚核苷酸锚定序列。利用第二个巢式GSP和一个与同聚核苷酸尾巴可以退火的锚定引物来扩增cDNA的5＇末端。

最初的5＇RACE系统是按照这个方法进行的，它首先利用SUPERSCRIPT™ RNase H RT来合成cDNA第一链，然后利用一个快速、有效的方法分离cDNA，通过一个简单的dC加尾系统来加尾，并使用了一个新颖的锚定引物，该引物带有脱氧次黄嘌呤，可以最大可能的有效、特异地从dC尾巴引发扩增发应。锚定引物设计时还可以选择提供UDG克隆位点，使获得5＇RACE产物很方便。

5＇RACE系统版本2保留了原始的5＇RACE系统基本策略和优点，同时包括下列一些改进：

1）利用无DNase的RNase H和RNase T1的混合物，来去掉制备好的cDNA中的RNA，以防止带有的RNA会抑制TdT加尾效果；

2）简单的5×加尾缓冲液；

3）高度纯化的重组TdT，适合于5＇RACE用。另外，重新设计的扩增引物符合带有古细菌DNA聚合酶（含有3＇到5＇外切核酸酶活性）的长PCR聚合酶混合物的需要。

由于5＇RACE系统的复杂性和单个基因特异性引物的使用（和锚定引物一起），使用Taq DNA聚合酶来扩增5＇末端片段长度受到限制，小于1.0kb。然而，最近PCR技术的进展使得可以PCR扩增的长度超过20kb。这种长PCR技术是基于在原来的热稳定聚合酶上，额外加有一定限量的带有3＇到5＇外切核酸酶活性的DNA聚合酶，原来通常使用的是Taq DNA聚合酶，缺少校正功能。

在这儿我们展示将长PCR技术应用到5＇RACE系统中，来分离5.5kb长的人结节性脑硬化II（tuberous sclerosis II，TSC-2）mRNA和8.9kb长的腺瘤性结肠息肉（adenomatous polyposis coli，APC）mRNA的5＇末端，扩增的5＇末端片段要比单独用Taq DNA聚合酶获得的片段长。

方法

使用5＇RACE系统版本2 （Cat. No. 18374-058）来扩增TSC-2和APC cDNA的5＇末端，利用TRIZOL®试剂，按照使用说明操作来分离HeLa S3细胞的总RNA，并增加用乙酸铵/乙醇来沉淀总RNA。5＇RACE中使用的引物，包括精简的锚定引物（Abridged Anchor Primer，AAP）和精简的通用扩增引物（Abridged Universal Amplification Primer，AUAP），以及TSC-2和APC的GSP如表1所示，引物名字上的数字代表引物3＇碱基在已发表序列中的位置，并在AAP序列的5＇端进行一些调整，所用的引物都由GIBCO BRL合成，脱盐沉淀，用无菌水稀释到10mM。PCR用的试剂，包括Taq DNA聚合酶，PCR SUPERMIX，和ELONGASETM扩增系统都来自Life Technologies（即现在的Invitrogen公司）。ELONGASE™酶混合物包括Taq DNA聚合酶和火球菌GB-D（Pyrococcus species GB-D）聚合酶。如果PCR单独使用Taq DNA聚合酶，5＇RACE系统版本2还带有用于UDG克隆的引物。