请教有关TSC2蛋白的转膜条件是什么？

xzmcjxj

2013-05-10

最近做TSC2蛋白（约200KDa）的western,上100微克的蛋白量，电泳没什么问题，湿转（1A,60min）,marker转上了，一抗（cell signaling，1:1000）室温30min,4度过夜，二抗孵育2h，最后什么也没显出来,所以怀疑是不是自己的湿转条件有问题，想请教一下有没有哪位大侠曾经做过这个蛋白，想请问一下你们的转膜条件，还有就是是不是因为细胞中这个蛋白含量比较低，所以显不出来，所以也想问下上样量是多少比较合适？

3 个回答

xzmcjxj

2013-05-24

有帮助

我做的是非磷酸化的TSC2，之前用的是NC膜，可能转膜时间不够，之后改用PVDF膜，1A，80min，最后显出条带，颜色也挺深的，所以怀疑还是转膜的时间不够，不过还是要感谢你们的回答~~~

天王盖地虎-0

2013-05-18

有帮助

Tuberin 我们也在做，或许可以把你的样本给我试试我手里的抗体

doluosi

2013-05-15

有帮助

细胞中的蛋白含量不算很低。上样量100ug已经算是很高了，20ug足矣。最后不显影有很多因素，从组织表达、蛋白提取、保存、电泳、上样、转膜甚至显色都有可能出现问题。分子量这么大，你配的胶的浓度是多少？从电泳后说起，转膜条件和显色液都应该考虑到。这个蛋白有磷酸化和非磷酸化的，你做的哪一个？尤其是前者，更应注意。