人类X染色质的观察

一、 实验目的

掌握观察与鉴别X染色质的简易方法，识别其形态特征及所在部位，为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件。

二、 实验原理

1、发现

1949年，加拿大学者Barr等人在雌猫的神经元细胞核中首次发现一种染色较深的浓缩小体，而在雄猫则没有这种结构。进一步研究发现，除猫外，其他雌性哺乳动物（包括人类）也同样有这种显示性别差异的结构。而且不仅是神经元细胞，在其他细胞的间期核中也可以见到这一结构。称之为巴氏小体，也称为X染色质。

正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深，大小约为1微米的三角形或椭圆形小体，即X染色质。间期核内X染色质的数目总是比X染色体的数目少1。正常女性有两条X染色体，因此只有一个X染色质；若有三条X染色体，就会有两个X染色质，余此类推。正常男性只有一条X染色体，所以没有X染色质。

2、莱昂假说

为什么正常男女之间的X染色质存在差异？女性两个X染色体上的每个基因座的两个等位基因所形成的产物，为什么不比只有一个X染色体半合子男性的相应基因产物多？为什么某一X连锁的突变基因纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？1961年，Mary Lyon 提出了X染色体失活的假说，即Lyon假说对这些问题进行了解释。其实验依据是对小鼠X连锁的毛色基因的遗传学观察。发现雌性小鼠毛色杂合体不表现显性性状，也不是中间类型，而是显性隐性两种颜色嵌合组成斑点状（不是共显性）。而雄性小鼠却从不表现斑点状毛色，而是显性或隐性单一颜色的毛色。

lyon假说的要点如下：

1）雌性哺乳动物体细胞内仅有一条X染色体是有活性的。另一条X染色体在遗传上是失活的，在间期细胞核中螺旋化而呈异固缩为X染色质。

2）X染色体的失活是随机的。异固缩的X染色体可以来自父方或来自母方。但是，一旦某一特定的细胞内的一个X染色体失活，那么此细胞而增殖的所有子代细胞 也总是这一个X染色体失活，即原来是父源的X染色体失活，则其子女细胞中失活的X染色体也是父源的。因此，失活是随机的，但是，是恒定的。

3）X染色体失活发生在胚胎早期，大约在妊娠的第16天。在此以前的所有细胞中的X染色体都是有活性的。

3、 剂量补偿：

细胞内的X染色体数目超过两条时，仍只有一条保持活性，其余的都形成异固缩的X染色质。正常男性只有一条X染色体，所以X染色质的数目为0。45，XO 性腺发育不全的患者虽然是女性，但是因为只有一条X染色体，所以细胞内无X染色质。一个细胞中所含的X染色质的数目等于X染色体数目减一。

剂量补偿：由于雌性细胞中的两个X染色体中的一个发生异固缩（也称为Lyon化现象），失去活性，这样保证了雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。这种效应称为X染色体的剂量补偿。

需要指出的是，失活的X染色体上基因并非都失去了活性，有一部分基因仍保持一定活性，因此X染色体数目异常的个体在表型上有别于正常个体，出现多种异常的临床证状。如47，XXY的个体不同于46，XY的个体；47，XXX的个体不同于 46，XX的个体，而且X染色体越多时，表型的异常更严重。

三、 实验步骤

1、口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察

刮取颊部粘膜上皮细胞（用灭菌玻璃片）→涂片（两片45°角）→60%冰醋酸固定5分钟→吸去冰醋酸，用改良苯酚品红染色1-2分钟→压片→镜检

2、发根细胞巴氏小体观察

拔取带毛囊头发一段→45%冰醋酸解离5分钟→剥取毛囊→染色2-3分钟→压片观察

在女性间期细胞核内侧靠近核膜处有约1微米大小的反光极强的颗粒状亮点，即为巴氏小体。材料不同，观察结果可能有不同，且必须和核仁区别开来（核仁往往离核膜较远或接近核中央部位）。

四、作业

1、分别观察男女各50个可数细胞，计算显示X染色质所占百分比。

2、观察中选绘4-5个典型细胞，示明X染色质体的形成和部位。

正常女性口腔粘膜细胞中约30-50%有一个巴氏小体，男性则低于1-2%。

注意事项

1、刮口腔上皮前要漱口；

2、刮时用灭菌玻璃片的宽边，勿用一角，以免划破口腔；

3、第一次刮下的脱落细胞用酒精棉球擦去，在原位重复刮一下制片；

4、盛放酒精棉球的小广口瓶，瓶盖用完即时盖好；

5、涂片略干再加改良苯酚口红；

6、染色时间不要太长，否则核质着色深，X染色质体不易区分；

7、毛囊细胞要充分解离，压片前可先用解剖针敲片，使细胞解离；

8、可数细胞的标准：核质染色呈网状或颗粒状；核膜清晰，无缺损；染色适度，周围无杂质。

Y 染色质：正常男性的间期细胞用荧光染料染色后，在细胞核内可出现一荧光小体，直径为0.3微米左右，称为Y染色质。Y染色体长臂远端部分为异染色质，可被荧光染料染色后发出荧光。这是男性特有的，女性细胞中不存在。细胞中Y染色质的数目与Y染色体的数目相同。如核型为47，XYY的个体，细胞核中有两个Y染色质。

所用器材与药品

灭菌玻璃片 60%冰醋酸 45%冰醋酸 改良苯酚品红 酒精棉球