贴壁细胞和悬浮细胞免疫荧光染色方法

一、细胞准备与固定

1、单层生长细胞：取对数生长细胞，用 0.25％ 胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。将细胞接种到预先放置几张 6×22 mm 盖玻片的培养瓶或培养皿中，置二氧化碳培养箱培养 1-3 天，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，进入 PBS（0.01 mol/L,pH7.4）洗 2 次，然后根据实验目的，选择适当固定剂固定细胞。常用固定剂有：95％ 乙醇（固定时间 10-30 min），丙酮（ 5－10 min）等。

2、悬浮生长细胞：取对数生长细胞，用 PBS 离心洗涤（1000rpm，5min）2 次，或用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片，把细胞片浸入 95％ 乙醇或丙酮中固定。

二、 将已经固定的细胞玻片放入盖片染色缸，用 PBS 振洗 5 min，取出吹干。

三、 滴加适当稀释的特异性抗体，置于湿盒内，37 度保温 30－60 min 或度冰箱过夜。

四、 PBS 振洗 3 次，每次 5 min，吹干。

五、 滴加适当稀释的荧光素标记抗体，置于湿盒内，37 度保温 30－60 min。

六、 PBS 振洗 2 次，每次 5 min，然后用蒸馏水振洗1次。

七、 50％ 缓冲甘油封片。

八、结果：在荧光显微镜下观察，阳性部位出现荧光，依荧光素种类不同呈现不同颜色的荧光，入 FITC 呈现黄绿色荧光，罗丹明 B200 呈现橙红色荧光。

标本染色反应后应及时观察并照相。若无时间立即观察标本，可把标本放入 4 度冰箱保存。但应注意，过夜后特异性荧光减弱 30％，一周后则减弱 50％。如果用聚乙烯醇封片，可保存较长时间。