Real-time PCR实验攻略
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北京协和医学院阜外心血管病医院心外科心血管病国家重点实验室吴益和分享
实验中必须坚持的一些好习惯
1. 加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均。
2. 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。
3. 所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因一. 防止RNA酶污染的措施。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180 ℃的高温下干烤6 h或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10 min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37 ℃处理12 h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22 μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩. 帽子. 手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类. 动物. 植物. 微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80 ℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1. 将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg组织加入1 ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×106个细胞加1 ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞； 2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30 ℃下放置5分钟；然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 在室温下（15 ℃～30 ℃）放置2～3分钟后，12 000 g（2 ℃～8 ℃）离心15分钟； 3. 取上层水相（离心后，混合物将分离为底层为浅红的. 中层为酚-氯仿相. 上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%）于一新的离心管，按每1 mlTrizol液加0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温（15 ℃～30 ℃）放置10分钟，12 000 g（2 ℃～8 ℃）离心10分钟。【如果希望分离DNA或蛋白质，保留中层和下层酚-氯仿相，有机相能保存在4°C一夜】
4. 弃去上清液（RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁），按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇进行洗涤，涡旋混匀，4 ℃下7 500 g离心5分钟【RNA能够在-20 °C保存在75%乙醇中至少1年，4°C保存至少1周】
5. 小心弃去上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会使RNA失去溶解性，导致A260/280 ratio <1.6。
6. 加适量Rnase-free water 溶解RNA沉淀，用枪头反复吸取混匀，55-60 ℃水浴10-15 min。进行下游实验或-70 ℃保存备用。
7. RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70 ℃。
预计的总RNA产量：
[注意]
1. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值 2. 加氯仿前的匀浆液可在-70 ℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。
总mRNA的提取(自己的经验)
一、关于Trizol Reagent需要的试剂
1. Chloroform：氯仿 (分析纯)
2. Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)
3. 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4. RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500 ml（50 ul），在37 ℃过夜，并高压灭菌即得（150 ℃ 3小时）
5. 一次性塑料手套
6. 注意：DEPC有致癌之嫌
7. 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50 ul，取10 ul加无Rnase水990 ul，稀释100倍成1 ml。于0.5 cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio <1.6。
8. 分离组织10 mg（纯组织）加800 ul Trizol试剂。
二、DEPC处理方法如下
1. DEPC处理
（1）DEPC水：100 ml超纯水加入0.2 ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2） Tip头(枪头）. EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37 ℃浸泡过夜，高压灭菌。
（1）DEPC水：100 ml超纯水加入0.2 ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2） Tip头(枪头）. EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37 ℃浸泡过夜，高压灭菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT 我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。
4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。 最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2 ml的0.1%DEPC水，再灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用处理的。
三、如何消除污染
机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。
（1） 试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。
（2） 加样：原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。 另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。 目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。
四、RNA定量
RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。 RNA的贮藏，最主要的是温度，-20不够，最好-80，液氮最保险 mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响。
五、RT-PCR有两种做法
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行 一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量。
六、mRNA的分离与纯化
步骤（4）中将RNA溶液置65 ℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
七、下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法：
保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1 000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70 ℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20 ℃冰箱中保存1 h。 时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件）， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70 ℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
八、PCR污染与对策
1. PCR扩增产物污染
这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。 还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
1)标本处理区，包括扩增摸板的制备；
2)PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；
3)产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。
2. 反应液污染 可采用下列方法之一处理：
1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5 U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；
2)尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照射的去污染作用对500 bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300 bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
a、提取mRNA时所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。
b、用DEPC水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用DEPC处理还有什么意义呢？还要用双蒸水洗吗？
c、玻璃器皿干烤：180度，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许氯仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。
RNA提取
一、RNA提取前的准备
1. 研钵的处理
1) 自来水反复冲洗；
2) 去污剂或者洗涤灵冲洗；
3) 自来水反复冲洗；
4) 蒸馏水浸泡1~2d；
5) 超净工作台内用无水乙醇冲洗2~3遍，晾干。（在RNA提取前，紫外杀菌10min）
2. 枪头及EP管的处理
1) 0.1%DEPC水浸泡1~2w；
2) 用镊子夹起枪头一一装入枪头盒中，用镊子夹起EP管放入饭盒中；
3) 高压灭菌50min，45度烘箱烘干。
二、RNA的提取
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80 ℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1. 将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg组织加入1 ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10×106个细胞加1 ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30 ℃下放置5分钟；然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 在室温下（15 ℃～30 ℃）放置2～3分钟后，12000 g（2 ℃～8 ℃）离心15分钟；
3. 取上层水相（离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%）于一新的离心管，按每1 mlTrizol液加0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温（15 ℃～30 ℃）放置10分钟，12000 g（2 ℃～8 ℃）离心10分钟。
4. 弃去上清液（RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁），按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇进行洗涤，涡旋混匀，4 ℃下7500 g离心5分钟。
5. 小心弃去上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
6. 加适量Rnase-free water 溶解RNA沉淀（60 ℃ 10 min）。-70 ℃保存备用。
7. RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70 ℃。
[注意]
1. 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值。
2. 加氯仿前的匀浆液可在-70 ℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。
在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA提取过程中注意避免mRNA 的断裂；取2 ug进行RNA检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂。
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程
一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)
不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）
二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA
三、RNA琼脂糖凝胶电泳
1. 1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：
1） 称取琼脂糖0.45 g放入三角瓶中，向其中加入4.5 ml的10×MOPS缓冲液和39.5 ml的DEPC水，放微波炉里溶化。
2） 待冷却到60摄氏度左右时，加入1 ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30 min。
2. 取各个RNA样品4 μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2 μl混匀，加入变性胶加样孔中。
3. 120V电压下电泳25 min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4. RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
另外还有一种RNA检测方法：
浓度检测：取4 μl RNA，加蒸馏水至1 000 μl，混匀。测OD260、OD280
四、RNA反转录为cDNA
反转录程序(以MBI的M-MLV为例)
反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求
1）随机六聚体引物：
当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：
是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3）特异性引物：
最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3'端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做 Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
① Tm=55-65 ℃
② GC=30-80%
③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300 bp之间都可。
④ 引物的退火温度要高，一般要在 60 ℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。
五、cDNA与引物质量检测
取0.2 ml薄壁PCR管，编号。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10 ul；加入正反向引物各0.5 ul（引物浓度10 uM） ，向管中加入混合的cDNA各1 ul。各管补加水至20 ul。
组份 加量
2×PCRTaqMix 10 ul
10 uMPrimer FW 0.5 ul
10 uMPrimer RV 0.5 ul
Template DNA 1 ul
ddH2O 混匀至20 ul
混匀，置于TP600PCR仪中。95 ℃ 5 min；95 ℃15 s，60 ℃35 s ，40 cycles；72 ℃ 5 min；4 ℃ pause。
取扩增产物各8 μl，DL2000 分子量标准5 μl/泳道。1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25 min。用凝胶紫外分析仪观察。
选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。
六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况
由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。
七、定量 PCR检测
取0.2 ml薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5 ul，10 uM各基因正反向引物混合物0.5 ul，对应的cDNA各1 ul。一管中不加模板用作阴性对照。各管补加水至25 ul。
混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后，95℃15 s→65℃35 s（荧光检测），40 cycles。荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。
（侯哥论文中的：95 °C 10分钟→95 °C 15秒→60 °C 1分钟；40个循环。）
以双△Ct值法计算靶基因相对表达水平：
GRP78相对表达水平=2-△(△CT)
注：△CT =Ct(GRP78)-Ct(GAPDH); △(△CT)= △CT (LLLI)- △CT (contro1)。
八、扩增曲线和溶解曲线
溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。
如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质；
如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。
如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免；
若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。
在溶解曲线中出现双峰有三种可能：
① 引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物；
② 在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰（只在引物跨内含子时存在），出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA；
③ 扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。
九、表达差异的计算方法
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。
2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000 拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。
2-△△CT方法的推导（详见实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量）
补充：在DNase I 消化样品RNA 中的DNA后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：
消化后总体积100 ul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加200 ulDEPC水。
1. 向离心管中加入等体积氯仿（约300 ul） ，剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。4℃14 000 rpm离心8 min，取上清（约250 ul）。
2. 加入1/10体积的NaAC（3 M）（约25 ul）和预冷的等体积异丙醇（约280 ul），-20℃放置20 min。
3. 4℃14 000 rpm离心15 min，去上清，注意不要触到沉淀。
4. 加入1 ml的75%乙醇，4℃14 000 rpm离心3 min，去上清。
5. 瞬时离心，用200 ul（或10 ul）的枪头小心吸去离心管底的残存液态（勿吸到管底的沉淀）。
6. 把离心管放置于超净台晾至约5-10 分钟（勿完全干燥，否则很难溶）。加入30~50 μl的无RNase的水，静止1 min 后，振荡30sec，瞬时离心。
7. 将提取的RNA立即进行下游实验，或放-20 ℃保存。
