红外线CO<sub>2</sub>气体分析仪测植物光合与呼吸速率(密闭系统斜率法)
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光合作用是地球上最重要的生命现象，它是唯一能把太阳能转化为稳定的化学能贮藏在有机物中的过程，是维持地球上物质循环的关键环节，也是农作物产量形成的决定性因素。在植物科学研究中，经常需要测定光合作用。
在光合作用（及呼吸作用）测定方法的发展过程中，曾经有过多次革新，其中包括测定干物质积累的称重法，测定CO2吸收（和释放）的滴定法，测氧气释放的检压法和氧电极法等。与这些方法相比，红外线气体分析仪（IRGA）堪称最先进的方法。它不但快速、准确，而且可将测定信号变为电信号输出，便于仪器的自动化和智能化。
近年来，国际上一些生理生态仪器公司生产了全自动光合作用测定仪，如英国PP Systems公司生产的CIRAS-1、CIRAS-2型便携式田间光合测定仪和美国拉哥公司生产的LI-6400型光合作用测定仪，都是当前国际上最先进的仪器，但价格较高。近几年也生产了一些价格相对低廉、适合教学使用的便携式光合作用测定系统，如TPS-1便携式光合作用测定系统（PP Systems公司）。
本实验密闭式气路系统以我国北京分析仪器厂生产的QGD-07 或GXH-305型红外线CO2气体分析仪为主机组成的系统进行光合和呼吸速率测定；开放式气路系统应用TPS-1光合作用测定系统。
1、 红外线CO2气体分析仪（IRGA）工作原理
许多由异原子组成的气体分子对红外线都有特异的吸收带。CO2的红外吸收带有四处，其吸收峰分别在2.69μm、2.77μm、4.26μm和14.99μm处，其中只有4.26μm的吸收带不与H2O的吸收带重叠，红外仪内设置仅让4.26μm红外光通过的滤光片，当该波长的红外光经过含有CO2的气体时，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少与CO2的浓度有关，并服从朗伯-比尔定律。分别供给红外仪含与不含CO2的气体，红外仪的检测器便可通过检测红外光能量的变化而输出反映CO2浓度的电讯号。
目前应用于光合作用研究的红外线CO2气体分析仪，按照测量气室的数量一般分为两种类型：单气室类型和双气室（或多气室）类型。单气室红外仪一般用于CO2浓度绝对值的测定；在双气室（或多气室）红外仪中，一个气室为分析气室，另一个作为参比气室，可测定参比气与分析气中CO2浓度之差。
2、IRGA法测定光合速率的气路系统
红外线CO2分析仪是测定CO2浓度的专用仪器，不能直接测定植物叶片的光合速率，必须根据IRGA的性能和测定目的，将IRGA与同化室组成一定的气路系统，才能进行叶片光合速率的测定。
常用的气路系统有密闭式和开放式两种。
（1）密闭式气路系统：被测定植物或叶片密闭在同化室中，不与同化室外发生任何的气体交换，同化室内的CO2浓度因光合作用而逐渐下降，可用IRGA连续监测同化室内CO2浓度的下降速率，根据叶片面积，同化室体积计算光合速率。
密闭式气路系统
P. 气泵 C. 同化室 D. 干燥器 A. 红外线 CO 2 分析仪
（2）开放式气路系统：该系统用双气室IRGA,以气泵为动力，将流经同化室前的空气（参比气）泵入一个气室，流经同化室后的空气（样本气）泵入另一个气室（分析气室），最后将气体排空，由仪器指示参比气和样本气的CO2浓度差，根据流量、同化室中叶片的面积，求出叶片的光合速率。
开放式气路系统
P. 气泵 F. 流量计 C. 同化室 D. 干燥器 A. 红外线 CO 2 分析仪
【原理】
把IRGA与光合作用同化室连接成密闭的气路系统。将植物材料密封在透明的同化室内，给以适当的光照，同化室内CO2浓度将因植物光合而下降，用IRGA配以适当的记录仪可绘出同化室内CO2浓度随时间下降的曲线。在同化室不漏气、光强度稳定、室内空气不断得到搅动的情况下，该曲线将是一条平滑曲线，在曲线的任一点作切线，即可根据切线的斜率，密闭系统的容积和同化室中叶片的面积求出在该点CO2浓度下的光合速率。
密闭气路光合测定装置：将QGD-07型红外线CO2气体分析仪、XWT-264型自动记录仪、MXQ型气体取样器、光合作用同化室、温度转换器（测温探头可放在同化室内，输出信号接记录仪）或半导体点温计、橡皮管（内径6~7mm）、塑料气球，连接成套，放在一辆医用小推车上。
量子辐射照度计；叶面积仪；铁架台（带试管夹）；0~50℃温度计（用以校正叶室温度）；剪刀；带盖搪瓷盘；纱布；小纸牌数个；记号笔；2号干电池（放在同化室手柄内，用作同化室风扇电源）或3V直流变压器。
【试剂】
无水氯化钙（或无水硫酸钙）；烧碱石棉（10目）或碱石灰。
【方法】
（一）光合速率的测定。
1、安装仪器
（1）将安装好的密闭气路光合测定装置安放在靠待测植株1~2m处，接通红外仪、记录仪、取样器、温度转换器的供电电源。打开红外仪电源开关预热1~2h,红外仪量程开关置于I档（0~500μL/L）。把红外仪和温度转换器的信号输出与记录仪的两个信号输入接线柱用导线接通。旋转记录仪第一支笔量程选择开关于10mV位置（与红外仪输出信号电压匹配），旋转记录仪第二支笔量程选择开关于2V位置（与温度转换器输出温度0~50℃信号电压匹配）。
（2）打开取样器顶部面板，取出过滤管装满烧碱石棉后复原，取出干燥管装满无水氯化钙后复原，取下连接取样器的气球，用口吹气至半满后复原。
（3）将同化室用试管夹固定在铁架台上，置待测植株前。
2、调、校仪器
（1）红外仪预热完毕后，开启记录仪电源开关、记录仪信号输入开关和取样器前面板上的气泵开关，将取样器F1旋钮置“零气”位置，F2旋钮置“测量”位置，开始调整红外仪的零点（此时无CO2无水分的零气循环经过红外仪），约1~2min,调节红外仪的调零旋钮使指针稳定在“0”点位置，稳定后，调节记录仪第一支笔的“调零”旋钮使记录笔到零点位置，红外仪调零完毕。
（2）拔下红外仪进气口处的橡皮管，改接CO2标准气（已知准确CO2浓度）钢瓶，出气口放空，让标准气流经红外仪分析气室（流量以1L/min左右为宜）开始校正，此时红外仪指针应指在标准气浓度所对应的刻度（μA值）上，否则可调节红外仪“校正”旋钮，使其达到。校正完毕后恢复原气路。
（3）把玻璃温度计感温端与叶室内的温度转换器探头放在一起（注意遮荫），从玻璃温度计上读出温度，迅速旋转记录仪第二支笔的调零旋钮，使记录笔置该温度所对应的位置，校正温度。
3、测定
（1）旋转取样器面板上F1旋钮至“测量”位置，把叶片平展放入同化室后关闭同化室（注意勿让操作者呼出的气体进入叶室），开启叶室风扇。观察记录笔开始左移时，迅速旋转记录仪“走纸变速”开关至合适档（以所划曲线与走纸方向的夹角45°左右为宜），开始记录CO2浓度变化（此时记录笔应从350μL/L左右开始记录）和温度变化，用铅笔在记录纸上记下所测叶片的编号、走纸速度，用量子辐射照度计测量所测叶片的受光强度（光子通量密度）并记录，待记录笔左移至310μL/L左右时，关闭走纸开关，停止记录，第一次测定完毕。
（2）旋转取样器面板上的F2旋钮至“补充”位置后，迅速复原，让气球内的高浓度CO2气进入同化室以补充CO2浓度至350μL/L左右，观察记录笔左移后迅速开启走纸开关，进行第二次重复测定，测量光照强度并记录，当记录笔左移至310μL/L左右时，关闭走纸开关，第二次重复测定完毕。如此再进行第三次重复测定。
（3）三次重复测定完毕后，关闭同化室内风扇，用记号笔在叶片的叶室内外相交处作标记，打开叶室，剪下叶片的测定部分，用纸牌编号后包在湿纱布内并放置于带盖搪瓷盘内，待测叶面积。然后再测定第二张叶片的光合速率。
（4）测定结束后，用叶面积仪测定各叶片面积（如有便携式叶面积仪，可在测定光合后，立即测出叶面积）。
4、计算
（1）IRGA的μA-CO2μL/L-CO2μL/（L·μA）对照表的制作。
QGD－07型IRGA表头读数（μA）与CO2浓度（μL/L）为非线性关系，厂方提供的标定曲线使用不方便，为了计算需要，需求出标准曲线各点上每变化1μA所代表的CO2浓度变化率〔CO2μL/（L·μA），即曲线在各点的斜率〕。用配方程法将厂方标定仪器时取得的μA（X）-CO2μL/L（Y）对应数据进行多项式回归，配以理想方程，并求该方程的一阶导数方程，然后将X值（μA）1~50的整数代入理想方程和导数方程，分别计算Y和Yˊ值，即可求出各μA值所对应的μL/L值和斜率（CO2μL/（L·μA））。
将各X、Y、Yˊ值列成对照表备计算用。
北京分析仪器厂新研制的GXH-305型红外线CO2气体分析仪已将表头输出与CO2浓度的关系线性化，可免去这一步计算。
（2）计算任一CO2浓度下的CO2浓度变化率
首先确定计算光合速率时的环境CO2浓度，一般可确定为大气CO2浓度320~340μL/L,在记录纸的每张叶片所记录的三次重复曲线上分别找出所确定的浓度点P，在该点对每条曲线作切线（若该点前后记录线是一直线，则可画一条与其重合的线），将切线延长，使其跨越一固定的μA值，标出线段AB,由A及B点分别作平行和垂直于基线的线段AC及BC，使相交于点C，构成直角三角形ABC，其中BC为走纸长度L（mm），L除以走纸速度v（mm/min），即得时间t（min）。三角形AC边代表在时间t内表头读数的变化n（μA值），由制好的对照表中查出P点（μA值）所对应的斜率r（CO2μL/（L·μA）），则在该P点CO2浓度变化率R为：
（3）计算光合速率 光合速率可用下列公式求得：
式中 Pn-净光合速率（单位为μmol·m-2·s-1）；-系统容积（包括同化室、红外仪气室、管路等的容积，单位为升）；-P点的CO2浓度变化率（单位为μL/（L·min））；-叶面积（单位为m2）；-气压（单位为MPa）；-同化室内温度（由记录纸上读出，℃）。
计算出同一叶片三次重复的光合速率后，求其平均值可作为该叶片的净光合速率。
5、注意事项
（1）密闭系统的最基本要求是严格密闭，不能漏气，否则无法测定。
（2）红外仪的滤光效果并不十分理想，水蒸汽是干扰测定的主要因素，因此，取样器干燥管内的CaCl2要经常更换，更要避免CaCl2吸水溶解进入分析气室。分析气室是红外仪的要害部件，价格昂贵，一旦被具有腐蚀性的CaCl2饱和溶液污染便无法正确测量，应特别注意保护。
（3）该方法也可用于测定植物群体的光合速率，但需将单叶同化室换成群体同化室。可用钢筋焊成长方体框架，覆以两端开口的透明塑料薄膜（上端的一侧要长出一段，以便测定时密封顶部），框架的顶部吊2~4个玩具风扇用以混匀室内空气，将进出气管和测温探头吊在室内（管口勿靠在一起）。测定时，底部的塑料薄膜用土埋好，顶端一侧长出的薄膜覆盖好顶部后，用铁夹将四周夹好（注意不能漏气）即可，其他与单叶光合测定方法相同。
（二）呼吸速率的测定
1、2同光合速率测定步骤1、2。
3、测定
旋转取样器面板上F1旋钮至“测量”位置，把叶片平展放入叶室后关闭叶室（勿让操作者的呼吸气进入叶室），用黑布将叶室包严密并用铁夹夹紧使其不透光，开启叶室风扇。观察记录笔开始右移时，迅速旋转记录仪的“走纸变速”开关至合适档，开始记录（此时记录笔应从320μL/L左右开始，若CO2浓度太高，可旋转取样器面板上F1旋钮至“调零”位置，使空气流经烧碱石棉管，将叶室内CO2吸收至320μL/L以下，再恢复至“测量”位置），待记录笔右移至360μL/L左右时，停止记录。以下同上述光合测定方法（3）、（4）。
4、计算
呼吸速率（Rr）计算同光合速率测定方法4。
（三）CO2-光合曲线的测定
利用密闭气路CO2斜率法，测定CO2-Pn曲线十分方便，步骤如下：
1、2同光合速率测定方法1、2.
3、测定
CO2同化速率对光强度的响应曲线
旋转取样器面板上的F1旋钮至“测量”位置，把叶片平展放入同化室并关闭同化室。开启风扇，红外仪量程开关至II档（0-1000μL/L），旋转取样器面板上F2旋钮至“补充”位置，向同化室内补充CO2气体，观察记录笔右移至近满刻度时，恢复F2至“测量”位置。待记录笔缓慢均匀左移时，开启走纸开关至合适档，每隔2~3min测量记录一次光强度，待记录笔画出的曲线大致与基线平行时，停止记录，关闭风扇。打开叶室，剪下叶片的测量部分，挂牌编号后包于湿纱布中，并置搪瓷盘内。如此测量5个叶片。在叶面积仪上测量、记录各叶片面积。
4、计算
按光合速率测定方法4（2）所述，在记录纸的每一条长曲线上，选10个以上的点，
分别计算各点斜率R值与光合速率Pn,再根据各点的μA值在对照表上查得相应的CO2浓度，即可得到10组以上的CO2-Pn一一对应值。以CO2浓度为横坐标，Pn为纵坐标即可画出CO2-Pn曲线。该曲线的直线部分之初始斜率，称为叶片导度，也可近似地看作羧化效率；将曲线内推找出曲线与横坐标的交点，即净光合速率为零时的CO2浓度，此浓度即为CO2补偿点；再内推至与纵坐标相交，此交点为无CO2空气中的CO2释放速率，可代表光呼吸速率（严格地讲应为光、暗呼吸之和）。也可在曲线的直线部分用计算机建立直线回归方程，求得直线方程的斜率为叶片导度；x=0时的y值（负值）为光呼吸速率；y=0时的x值为CO2补偿点。
5、注意事项
（1）测定CO2-Pn曲线要求光强度和温度稳定，可在人工光源和控温条件下进行。
（2）若专为测定CO2补偿点及光呼吸，可不必从高CO2浓度做起，除红外仪改用I档外，还可通过取样器的F1旋钮，将同化室内CO2浓度降低。
