神经细胞培养大全
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一、新生大鼠大脑皮层神经元分散培养
大脑皮质是大脑半球最外表的一层灰质，大脑皮质内神经元的数量极大，其类型也很多，但均属多极神经元，神经元之间具有复杂的联系，反映皮质的高度发展。有人从机能上将皮质分为：感觉皮质、联络皮质、运动皮质。
1. 材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧皮层，培养方法同海马神经元培养。
2. 新生大鼠大脑皮层神经元的生长分化和形态特征
新生大鼠皮层元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠海马神经元相似。培养的皮层神经元中既可见到体积较大(直径8-12 μm)的锥体细胞和颗粒细胞(如星状细胞、篮状细胞和梭形细胞),也可见到马提诺蒂细胞,胞体较小,呈三角形或多角形。随着培养时间的延长, 神经元胞体逐渐增大,突起增粗。新生大鼠皮层神经元亦可持续培养2个月。
二、新生大鼠纹状体神经元培养
位于大脑皮质下，紧靠丘脑背外侧的几块灰质，称为基底神经节，它们包括尾状核、壳核和苍白球，前两者合起来又称为纹状体。纹状体是中枢神经系统的高级部位，在这里进行着运动机能的最高级整合，它们与随意运动的稳定、肌紧张和躯体运动的整合有密切关系。中脑黑质除含有较多的多巴胺(DA)神经元外，还含有γ-氨基丁酸(GABA)神经元等，纹状体是其主要的靶组织，共同组成黑质纹状体DA系统。
三、新生大鼠中脑黑质神经元培养
黑质由中脑背侧的致密部和腹侧的网状部组成，中脑黑质是多巴胺神经元存在的部位，实验表明，大鼠中脑腹侧多巴胺在运动和行为中起着关键性的作用。黑质多巴胺能神经元退性病变可引起帕金森综合症。因此，多巴胺神经元的体外培养为多巴胺神经元的形态、受体分布、药物作用、电生理特性的研究以及多巴胺神经元移植研究提供了较好的实验手段。
1. 材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧黑质，培养方法同海马神经元培养。
2. 新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征
新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠下丘脑神经元相似。培养的中脑黑质神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形,直径6-8 μm，随着培养时间的延长, 中脑黑质神经元胞体逐渐增大。中脑黑质神经元亦可维持培养2个月。
四、新生大鼠小脑神经神经元培养
小脑由外层的灰质(皮质)、内部的白质和三对深部的核团(顶核、间位核和齿状核)组成。与大脑皮质相比，小脑皮质的结构和神经元环路的组成相对简单，整个小脑皮质共有三层结构：分子层、浦肯野细胞层和颗粒层。其中含有五种神经元，即颗粒细胞，浦肯野细胞、篮状细胞、星形细胞和高尔基细胞。小脑是中枢神经系统中最大的运动机构，主要作用是维持躯体平衡，调节肌肉张力和协调随意运动。小脑的另一个与运动有关的重要功能是在技巧性运动的获得和建立过程中发挥运动学习的作用。在体外培养系统中，小脑细胞大小和形态的特征明显，容易识别。另外，小脑缺陷神经突变的小鼠种系比较多，这些条件都使小脑细胞成为发育研究的良好对象。
1. 材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧小脑，培养方法同海马神经元培养。
2. 新生大鼠小脑神经细胞的生长分化和形态特征
新生大鼠小脑神经元的生长分化基本和新生大鼠皮层神经元相似。培养的小脑神经元以颗粒细胞为多见,体积较小,直径3-5 μm,亦可见到一定数量的星状细胞,哺肯野细胞和篮状细胞(胞体直径6-8 μm),它们均随着培养时间的延长,神经元胞体逐渐增大,突起逐渐增粗。新生大鼠小脑神经元亦可持续培养2个月。
五、新生大鼠脑腺垂体细胞培养
大鼠的垂体分为前、中、后三叶，前叶亦称腺垂体，主要分泌生长激素、催乳素、各种促激素及黑素细胞刺激素。因此建立体外培养腺垂体细胞的方法，可用来探讨各种因素直接对细胞分泌功能的影响，以及开展神经内分泌分子生物学的研究。
1. 材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下分离出腺垂体，用0.125%胰蛋白酶消化(36 ℃、30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成2×106个细胞/ml密度的细胞液, 接种于涂有小牛皮胶的35 mm塑料培养皿中,每皿2 ml,置标本于36 ℃,含10%CO2的培养箱内培养。24 h后顷去培养皿内种植培养液,改用饲养培养液(同第二节)培养。以后每周换液2次,每次更换50%新鲜培养液。
2. 新生大鼠脑腺垂体细胞的生长形态特征
接种后24 h,新生大鼠脑腺垂体分散细胞即开始贴附在胶元薄膜上生长,脑腺垂体细胞最初分散或聚集成小团,随后迅速分裂增殖。细胞境界清楚, 形状不规则,有圆形,卵圆或多角形。核位于胞体中央或偏于胞体一侧,可见1-2个核仁。随着培养时间的延长,脑腺垂体细胞胞体逐渐增大,形成单层, 铺满皿壁底层。脑腺垂体细胞可持续培养1个月。
六、神经胶质细胞培养
(一)雪旺细胞
雪旺细胞(Schwann cell，SC)是外周神经系统最主要的胶质细胞，也是外周神经的成髓鞘细胞;它形成髓鞘，或包裹轴突而不形成髓鞘。雪旺细胞的功能极其活跃，一旦神经受损，它能反应性分裂增殖，分泌神经营养因子，产生细胞外基质和细胞粘附分子，对神经元及其轴突起营养和修复作用。近年来的研究表明，雪旺细胞也能促进中枢神经对脱髓鞘损伤的修复，如对脊髓的再生，对视网膜神经节以及对隔-海马通路再生等。说明雪旺细胞也能改善中枢神经再生的微环境，因而近年来对雪旺细胞的研究，尤其是体外培养研究已成热点。
1. 材料和方法
雪旺细胞培养取材于各类哺乳动物的外周神经和背根神经节，取孵化8-12 d鸡胚、出生1-3 d 的小鼠或大鼠和人工流产的人胎儿，在无菌条件下用解剖镊分离出神经节，剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37 ℃ 30min)后用培养液( 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2 mM谷氨酰胺)吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的35 mm塑料培养皿中, 种植密度为0.2×105 个细胞/ml，每皿2ml细胞悬液置。置36 ℃、10%CO2培养箱中培养。接种第3 d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2-脱氧尿苷15 μg/ml和尿苷35 μg/ml，以进一步去除成纤维细胞, 作用48小时后更换新鲜培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2. 雪旺细胞的生长和形态特征
培养15 d后可获得较高纯度的雪旺细胞，雪旺细胞呈双极梭状，核卵居中，相互平行排列，经S-100免疫组织化学染色呈阳性反应。增殖分裂的雪旺细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。
(二)星形胶质细胞
星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大，数量最多的一种，胞体呈星形，核大，呈卵圆形，染色质稀少，星形胶质细胞分两类，一类为原浆性星形胶质细胞(protoplasmic astrocyte)，其突起短粗，分枝多。另一种为纤维性星形胶质细胞(fibrous astrocyte)，它的突起细长，分枝少。纤维性星形胶质细胞是与少突胶质细胞源自同一前体细胞。星形胶质细胞具有多种功能，中枢神经系统内神经元及其突起间的空隙几乎全部由星形胶质细胞充填，起结构的支持作用，星形胶质细胞的突起构成血脑屏障，星形胶质细胞能摄取和代谢某些神经递质如γ-氨基丁酸等。调节局部神经递质的浓度，使神经网络能平稳地发挥作用。还能吸收细胞间隙中过多的K+，为K+的存储库，通过调节K+的水平而影响神经元的电生理活动。星形胶质细胞能合成和分泌大量神经营养因子，有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用，亦能分泌白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等多种细胞因子，星形胶质细胞有分裂能力，在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生、肥大，填补缺损，形成胶质瘢痕。
方法和结果
选择出生 2 d 的SD大鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化(37 ℃ 30min)后用培养液( 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺)吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的75cm2塑料培养瓶中, 种植密度为1×105 个细胞/cm2，每瓶10 ml细胞悬液置。置36 ℃、10%CO2培养箱中培养。每周换液2 次，培养10-14 h，细胞分为两层，下一层为I型胶质细胞即原浆形胶质细胞，上一层是O-2A前体细胞，根据两类细胞贴壁能力的差异，以振荡培养技术进行分选，在37 ℃摇床上振荡，16 h(180 r/min)O-2A前体细胞可被摇下来，摇下来的细胞种植在涂有鼠尾胶的75mcm2塑料培养瓶中，培养液使用20 % 胎牛血清促进O-2A前体细胞分化为II型胶质细胞即纤维型胶质细胞。可分裂增殖的原浆形胶质细胞和纤维型胶质细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。纯度鉴定可用胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)染色确定。
(三)少突胶质细胞
1. 方法和结果
少突胶质细胞培养方法同星形胶质细胞培养。少突胶质细胞比星形胶质细胞小，光镜下少突胶质细胞胞体呈圆形或多角形，突起呈串珠状，根据其所在部位的不同可分为束间少突胶质细胞、神经元周围少突胶质细胞。在中枢神经系统内，少突胶质细胞主要形成及维持髓鞘。
讨论
在神经生理、生化和神经药理的研究中、神经细胞的体外培养日益受到重视,因为它是研究单个神经细胞功能和结构的适宜方法。在体外培养条件下背根神经节、颈上交感节、胚胎脊髓和不同脑区 (海马、隔、下丘脑、大脑皮层、小脑和垂体细胞等)培养细胞的形态特征都不尽相同，这与它们具有不同功能有关。交感和感觉神经元以及不同脑区神经元的体外培养成功, 为我们深入研究它们的结构和功能提供了合适的体外实验模型。在背根节神经细胞培养过程中, 我们观察到, 早期感觉神经元发育阶段,NGF是必不可少的营养因子,但在培养后期,神经元已发育成熟, 可能非神经细胞分泌的极少量NGF即能满足神经元生长需要,因此不另NGF也能维持长期培养。在上颈交感节细胞分散培养过程中, 我们亦观察到,若最初1-2d在培养液中缺乏 NGF,交感神经元突起不见生长,且大多死亡。培养15d或1个月时,如果培养液中未加入NGF, 本来生长良好的神经元很快便出现颗粒变性或空泡, 逐渐死亡。
结果表明NGF对于促进神经突起生长和维持神经元生存有显著作用。在神经细胞培养过程中,神经细胞的生长发育受到多种因素的影响,其中细胞接种密度对细胞生长发育影响较大,一般神经细胞的接种密度以0.5-1×106 个细胞/ml密度为宜,如每毫升中超过3×106个细胞/ml密度 ,将使细胞簇过大,而且培养皿内过分拥挤, 影响存活和生长。但如果培养的细胞数目过少时,神经细胞的生长分化较差,因为神经细胞是一种细胞群体, 它们相互之间具有营养和支持作用。其次是控制非神经元细胞过多增殖。原代分散单层培养是神经细胞与非神经细胞的混合培养。其中胶质细胞等可在体外继续增殖, 神经元则不能增殖而只能生长分化。
当适量胶质细胞的存在是神经细胞长期培养的必要条件,但如果神经胶质细胞过渡增殖时，神经细胞的生长分化便受到一定影响, 常使神经细胞提早开始退化。这可能是由神经胶质细胞频繁分裂过程中, 夺取了神经细胞生长中需要的某种营养成份。为保证神经元生长所需的营养, 需在非神经细胞增殖的高峰即所谓“合流”(confluence)时,将一定量的抗DNA 药物加入培养液中以抑制其过渡增殖,实验证明,在培养第5 d 或第7 d时使用 5-氟-2-脱氧尿苷15 μg/ml和尿苷35 μg/ml或阿糖胞苷3 μg/ml,作用48h即停用可加快神经元的分化, 延长培养时间。
再次是所配制的培养液必须保持一定的等渗性, 溶解于培养基的物质浓度所产生的等渗性必须与细胞外液的液体一致,培养神经细胞可将培养液的渗透压调节到320-330 mOso 较为合适。如果培养液是高渗的,细胞会失去水份并发生皱缩, 如果培养液是低渗的, 细胞会吸收水分而膨胀。两者不利于神经细胞的存活和生长。 最后需注意的是须掌握换液的次数和数量。为了使神经细胞得到生长分化必须的营养,必须经常进行换液,但如果换液次数太多,并不利于神经细胞的生长分化,因为神经细胞在培养液中需要适当的环境,而且它本身也有创造良好环境的能力, 如果频繁换液就会破环这种环境。我们每周换液二次,每次只换一半, 保留一半原液。除此之外,培养液的PH、温度等均对神经元的生长发育有影响,因而在实验中必须加以注意。
八、新生大鼠大脑皮层神经元分散培养
大脑皮质是大脑半球最外表的一层灰质，大脑皮质内神经元的数量极大，其类型也很多，但均属多极神经元，神经元之间具有复杂的联系，反映皮质的高度发展。有人从机能上将皮质分为：感觉皮质、联络皮质、运动皮质。
1. 材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧皮层，培养方法同海马神经元培养。
2. 新生大鼠大脑皮层神经元的生长分化和形态特征
新生大鼠皮层元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠海马神经元相似。培养的皮层神经元中既可见到体积较大(直径8-12 μm)的锥体细胞和颗粒细胞(如星状细胞、篮状细胞和梭形细胞),也可见到马提诺蒂细胞,胞体较小,呈三角形或多角形。随着培养时间的延长, 神经元胞体逐渐增大,突起增粗。新生大鼠皮层神经元亦可持续培养2个月。
九、新生大鼠纹状体神经元培养
位于大脑皮质下，紧靠丘脑背外侧的几块灰质，称为基底神经节，它们包括尾状核、壳核和苍白球，前两者合起来又称为纹状体。纹状体是中枢神经系统的高级部位，在这里进行着运动机能的最高级整合，它们与随意运动的稳定、肌紧张和躯体运动的整合有密切关系。中脑黑质除含有较多的多巴胺(DA)神经元外，还含有γ-氨基丁酸(GABA)神经元等，纹状体是其主要的靶组织，共同组成黑质纹状体DA系统。
十、新生大鼠中脑黑质神经元培养
黑质由中脑背侧的致密部和腹侧的网状部组成，中脑黑质是多巴胺神经元存在的部位，实验表明，大鼠中脑腹侧多巴胺在运动和行为中起着关键性的作用。黑质多巴胺能神经元退性病变可引起帕金森综合症。因此，多巴胺神经元的体外培养为多巴胺神经元的形态、受体分布、药物作用、电生理特性的研究以及多巴胺神经元移植研究提供了较好的实验手段。
1. 材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧黑质，培养方法同海马神经元培养。
2. 新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征
新生大鼠中脑黑质神经元的生长分化和形态特征基本上和新生大鼠下丘脑神经元相似。培养的中脑黑质神经元大多为具有两个突起的双极神经元,神经元胞体呈椭圆形,直径6-8 μm，随着培养时间的延长, 中脑黑质神经元胞体逐渐增大。中脑黑质神经元亦可维持培养2个月。
十一、新生大鼠小脑神经神经元培养
小脑由外层的灰质(皮质)、内部的白质和三对深部的核团(顶核、间位核和齿状核)组成。与大脑皮质相比，小脑皮质的结构和神经元环路的组成相对简单，整个小脑皮质共有三层结构：分子层、浦肯野细胞层和颗粒层。其中含有五种神经元，即颗粒细胞，浦肯野细胞、篮状细胞、星形细胞和高尔基细胞。小脑是中枢神经系统中最大的运动机构，主要作用是维持躯体平衡，调节肌肉张力和协调随意运动。小脑的另一个与运动有关的重要功能是在技巧性运动的获得和建立过程中发挥运动学习的作用。在体外培养系统中，小脑细胞大小和形态的特征明显，容易识别。另外，小脑缺陷神经突变的小鼠种系比较多，这些条件都使小脑细胞成为发育研究的良好对象。
1. 材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下取脑、分离出双侧小脑，培养方法同海马神经元培养。
2. 新生大鼠小脑神经细胞的生长分化和形态特征
新生大鼠小脑神经元的生长分化基本和新生大鼠皮层神经元相似。培养的小脑神经元以颗粒细胞为多见,体积较小,直径3-5 μm,亦可见到一定数量的星状细胞,哺肯野细胞和篮状细胞(胞体直径6-8 μm),它们均随着培养时间的延长,神经元胞体逐渐增大,突起逐渐增粗。新生大鼠小脑神经元亦可持续培养2个月。
十二、新生大鼠脑腺垂体细胞培养
大鼠的垂体分为前、中、后三叶，前叶亦称腺垂体，主要分泌生长激素、催乳素、各种促激素及黑素细胞刺激素。因此建立体外培养腺垂体细胞的方法，可用来探讨各种因素直接对细胞分泌功能的影响，以及开展神经内分泌分子生物学的研究。
1. 材料和方法
取当天出生的Wistar大鼠,在无菌条件下分离出腺垂体，用0.125%胰蛋白酶消化(36 ℃、30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成2×106个细胞/ml密度的细胞液, 接种于涂有小牛皮胶的35 mm塑料培养皿中,每皿2 ml,置标本于36 ℃,含10%CO2的培养箱内培养。24 h后顷去培养皿内种植培养液,改用饲养培养液(同第二节)培养。以后每周换液2次,每次更换50%新鲜培养液。
2. 新生大鼠脑腺垂体细胞的生长形态特征
接种后24 h,新生大鼠脑腺垂体分散细胞即开始贴附在胶元薄膜上生长,脑腺垂体细胞最初分散或聚集成小团,随后迅速分裂增殖。细胞境界清楚, 形状不规则,有圆形,卵圆或多角形。核位于胞体中央或偏于胞体一侧,可见1-2个核仁。随着培养时间的延长,脑腺垂体细胞胞体逐渐增大,形成单层, 铺满皿壁底层。脑腺垂体细胞可持续培养1个月。
十三、神经胶质细胞培养
(一)雪旺细胞
雪旺细胞(Schwann cell，SC)是外周神经系统最主要的胶质细胞，也是外周神经的成髓鞘细胞;它形成髓鞘，或包裹轴突而不形成髓鞘。雪旺细胞的功能极其活跃，一旦神经受损，它能反应性分裂增殖，分泌神经营养因子，产生细胞外基质和细胞粘附分子，对神经元及其轴突起营养和修复作用。近年来的研究表明，雪旺细胞也能促进中枢神经对脱髓鞘损伤的修复，如对脊髓的再生，对视网膜神经节以及对隔-海马通路再生等。说明雪旺细胞也能改善中枢神经再生的微环境，因而近年来对雪旺细胞的研究，尤其是体外培养研究已成热点。
1. 材料和方法
雪旺细胞培养取材于各类哺乳动物的外周神经和背根神经节，取孵化8-12 d鸡胚、出生1-3 d 的小鼠或大鼠和人工流产的人胎儿，在无菌条件下用解剖镊分离出神经节，剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37 ℃ 30min)后用培养液( 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2 mM谷氨酰胺)吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的35 mm塑料培养皿中, 种植密度为0.2×105 个细胞/ml，每皿2ml细胞悬液置。置36 ℃、10%CO2培养箱中培养。接种第3 d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2-脱氧尿苷15 μg/ml和尿苷35 μg/ml，以进一步去除成纤维细胞, 作用48小时后更换新鲜培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2. 雪旺细胞的生长和形态特征
培养15 d后可获得较高纯度的雪旺细胞，雪旺细胞呈双极梭状，核卵居中，相互平行排列，经S-100免疫组织化学染色呈阳性反应。增殖分裂的雪旺细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。
(二)星形胶质细胞
星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大，数量最多的一种，胞体呈星形，核大，呈卵圆形，染色质稀少，星形胶质细胞分两类，一类为原浆性星形胶质细胞(protoplasmic astrocyte)，其突起短粗，分枝多。另一种为纤维性星形胶质细胞(fibrous astrocyte)，它的突起细长，分枝少。纤维性星形胶质细胞是与少突胶质细胞源自同一前体细胞。星形胶质细胞具有多种功能，中枢神经系统内神经元及其突起间的空隙几乎全部由星形胶质细胞充填，起结构的支持作用，星形胶质细胞的突起构成血脑屏障，星形胶质细胞能摄取和代谢某些神经递质如γ-氨基丁酸等。调节局部神经递质的浓度，使神经网络能平稳地发挥作用。还能吸收细胞间隙中过多的K+，为K+的存储库，通过调节K+的水平而影响神经元的电生理活动。星形胶质细胞能合成和分泌大量神经营养因子，有维持神经元生存和促进神经元突起生长的作用，亦能分泌白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等多种细胞因子，星形胶质细胞有分裂能力，在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞增生、肥大，填补缺损，形成胶质瘢痕。
方法和结果
选择出生 2 d 的SD大鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化(37 ℃ 30min)后用培养液( 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺)吹打分散成细胞悬液，先接种于玻璃培养瓶中，于培养箱中孵育30 min后，翻转瓶子吸出细胞悬液，除去已贴壁的成纤维细胞，再接种于涂有鼠尾胶的75cm2塑料培养瓶中, 种植密度为1×105 个细胞/cm2，每瓶10 ml细胞悬液置。置36 ℃、10%CO2培养箱中培养。每周换液2 次，培养10-14 h，细胞分为两层，下一层为I型胶质细胞即原浆形胶质细胞，上一层是O-2A前体细胞，根据两类细胞贴壁能力的差异，以振荡培养技术进行分选，在37 ℃摇床上振荡，16 h(180 r/min)O-2A前体细胞可被摇下来，摇下来的细胞种植在涂有鼠尾胶的75mcm2塑料培养瓶中，培养液使用20 % 胎牛血清促进O-2A前体细胞分化为II型胶质细胞即纤维型胶质细胞。可分裂增殖的原浆形胶质细胞和纤维型胶质细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。纯度鉴定可用胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)染色确定。
(三)少突胶质细胞
1. 方法和结果
少突胶质细胞培养方法同星形胶质细胞培养。少突胶质细胞比星形胶质细胞小，光镜下少突胶质细胞胞体呈圆形或多角形，突起呈串珠状，根据其所在部位的不同可分为束间少突胶质细胞、神经元周围少突胶质细胞。在中枢神经系统内，少突胶质细胞主要形成及维持髓鞘。
讨论
在神经生理、生化和神经药理的研究中、神经细胞的体外培养日益受到重视,因为它是研究单个神经细胞功能和结构的适宜方法。在体外培养条件下背根神经节、颈上交感节、胚胎脊髓和不同脑区 (海马、隔、下丘脑、大脑皮层、小脑和垂体细胞等)培养细胞的形态特征都不尽相同，这与它们具有不同功能有关。交感和感觉神经元以及不同脑区神经元的体外培养成功, 为我们深入研究它们的结构和功能提供了合适的体外实验模型。在背根节神经细胞培养过程中, 我们观察到, 早期感觉神经元发育阶段,NGF是必不可少的营养因子,但在培养后期,神经元已发育成熟, 可能非神经细胞分泌的极少量NGF即能满足神经元生长需要,因此不另NGF也能维持长期培养。在上颈交感节细胞分散培养过程中, 我们亦观察到,若最初1-2d在培养液中缺乏 NGF,交感神经元突起不见生长,且大多死亡。培养15d或1个月时,如果培养液中未加入NGF, 本来生长良好的神经元很快便出现颗粒变性或空泡, 逐渐死亡。结果表明NGF对于促进神经突起生长和维持神经元生存有显著作用。在神经细胞培养过程中,神经细胞的生长发育受到多种因素的影响,其中细胞接种密度对细胞生长发育影响较大,一般神经细胞的接种密度以0.5-1×106 个细胞/ml密度为宜,如每毫升中超过3×106个细胞/ml密度 ,将使细胞簇过大,而且培养皿内过分拥挤, 影响存活和生长。但如果培养的细胞数目过少时,神经细胞的生长分化较差,因为神经细胞是一种细胞群体, 它们相互之间具有营养和支持作用。其次是控制非神经元细胞过多增殖。原代分散单层培养是神经细胞与非神经细胞的混合培养。其中胶质细胞等可在体外继续增殖, 神经元则不能增殖而只能生长分化。当适量胶质细胞的存在是神经细胞长期培养的必要条件,但如果神经胶质细胞过渡增殖时，神经细胞的生长分化便受到一定影响, 常使神经细胞提早开始退化。这可能是由神经胶质细胞频繁分裂过程中, 夺取了神经细胞生长中需要的某种营养成份。为保证神经元生长所需的营养, 需在非神经细胞增殖的高峰即所谓“合流”(confluence)时,将一定量的抗DNA 药物加入培养液中以抑制其过渡增殖,实验证明,在培养第5 d 或第7 d时使用 5-氟-2-脱氧尿苷15 μg/ml和尿苷35 μg/ml或阿糖胞苷3 μg/ml,作用48h即停用可加快神经元的分化, 延长培养时间。再次是所配制的培养液必须保持一定的等渗性, 溶解于培养基的物质浓度所产生的等渗性必须与细胞外液的液体一致,培养神经细胞可将培养液的渗透压调节到320-330 mOso 较为合适。如果培养液是高渗的,细胞会失去水份并发生皱缩, 如果培养液是低渗的, 细胞会吸收水分而膨胀。两者不利于神经细胞的存活和生长。 最后需注意的是须掌握换液的次数和数量。为了使神经细胞得到生长分化必须的营养,必须经常进行换液,但如果换液次数太多,并不利于神经细胞的生长分化,因为神经细胞在培养液中需要适当的环境,而且它本身也有创造良好环境的能力, 如果频繁换液就会破环这种环境。我们每周换液二次,每次只换一半, 保留一半原液。除此之外,培养液的PH、温度等均对神经元的生长发育有影响,因而在实验中必须加以注意。
