乳鼠心肌细胞培养方法详述

一、材料

所需液体：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。

试剂 Trypsin, SDS, DMEM 均购于 Sigma Chemical Co.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司，其余均为国产分析纯。

取鼠：标准SD大鼠，鼠盆用棉铺好，取鼠。

物品：白大衣、饭盒

小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）

瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]

250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]

500ml烧杯1个，用作废液缸。

50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）

三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）

离心管及帽（12-14个），两个试管

吸管 （5~8个）；大镊子（两把，持物，例夹棉球等）

台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用 2个、微量加样器 1000ml及500ml

以上物品均用紫外线照30分钟。

另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。

事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开，把瓶皿摆好，再用一个瓶皿装酒精棉球。

二、培养方法：

事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液），用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

具体方法为：

1、把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中，分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入0.1％新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。

2、取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁，铺纱布、换手套。

3、用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶，然后将其中少许放入50ml的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。

4、把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三角烧杯，少温度会不均匀）。打开磁力搅拌器电源，调温度（使-缓慢加到34~35℃）和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行）。一定要注意监控。

5、温度达到34℃时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情况而定。在此期间，在试管架上摆上5、6个离心管，标上1、1，2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升

6、10分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（1）用后固定放在一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后向两个1号管分别倒入2ml上清（尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（2）混匀配平两个管（即两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。

7、接着把这两个离心管放入离心机中，调10分钟，800或1000转，打开关。

8、同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶，继续消化8分钟，注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。

9、取下三角烧瓶，仍用1号吸管吹打，后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清，取出两个离心后的1号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（1个1号管，两个2号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34℃时计时）。

10、消化到4次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察消化情况，决定消化次数。

11、离心2次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多少DMEM液的量，换吸管（3号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入50ml烧杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中，加入小牛血清及抗生素，换吸管（4号）吹打均匀。

12、取出24孔培养板，一个人吹打，另一个人用加样器加药。封盖时过火，盖上盖，放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。

（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液时每孔加1~1.5ml）

三、讨论

乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞，培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法，我们在试验中摸索到0.06％浓度的胰酶对细胞损害较小，比起一些文献记载的0.15％浓度有一定的优越性，但这个浓度消化所需时间较长，所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同, 采用差速贴壁1 h, 除去成纤维细胞，达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。很好和心肌细胞鉴别[1]。

心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在一天左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好，DMEM培养基在初始培养时为深红色，两天后变为淡黄色，应该是营养成分下降的表现，也说明细胞生长状况良好。我们也参考了一些国外文献的培养方法加以补充[2]。

四、参考文献

1.Wang HX, Zhang WM, Sheng JZ, Wong TM. High carbachol increases the electrically induced [Ca2+]I transient in the single isolated ventricular myocyte of rats [J]. Eur J Pharmacol, 1997；319：91-9.

2.Animal cell culture methods edited by Jennie P.Mather and David Barnes.--California:Academic Press,c1998.--xiv,368p.24cmSBN0124800408:CNY619.26.