心肌细胞培养方法详述

一、实验准备

1. 配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。

2. 取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。

3. 准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。

用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

4. 物品：白大衣、饭盒

小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）

瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]

250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]

500ml烧杯1个，用作废液缸。

50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）

三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）

离心管及帽（12-14个），两个试管

吸管 （5~8个）大镊子 （两把，持物，例夹棉球等）

台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用 2个、微量加样器 1000ml及500ml

以上物品均用紫外线照30分钟。

另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。

事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开，把瓶皿摆好，再用一个瓶皿装酒精棉球。

二、培养过程

1. 把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中，分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠，放入0.1％新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用针头把鼠固定（位置摆正），用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘，取一把小剪子及小镊子开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。

2. 取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。（鼠全部杀死后，把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁，铺纱布、换手套。

3．用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶，然后将其中少许放入50ml的小烧杯中，大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入三角烧瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰酶刷净烧杯。

4．把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中，（事先调好水量，多会没过三角烧杯，少温度会不均匀）。打开磁力搅拌器电源，调温度（使-缓慢加到34~35℃）和转速（转速不可过快，否则会打碎细胞，基本上标志为平行）。一定要注意监控。

5．温度达到34℃时开始计时，第一次为10分钟，以后可为8分钟，事情况而定。在此期间，在试管架上摆上5、6个离心管，标上1、1，2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升。

6．10分钟后，把三角烧瓶取下，磁力搅拌器关上，用一个吸管轻轻吹打（使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来），这个吸管（1）用后固定放在一个离心管中，以后每次消化后取下都用其吹打几下，第一次上清弃去，然后向两个1号管分别倒入2ml上清（尽量不要把组织倒出，也不要剩液太多，以免消化下的细胞重复消化造成损伤），用另一个吸管（2）混匀配平两个管（即两个管水平高度相同），轻轻吹打，以免损坏细胞。

7．接着把这两个离心管放入离心机中，调10分钟，800或1000转，垫小锁，打开关。

8．同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶，继续消化8分钟，注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。

9．取下三角烧瓶，仍用1号吸管吹打，后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清，取出两个离心后的1号管，把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的DMEM液，用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中，把管底的沉淀细胞洗下来，把液体全部移入其中一管，三个管（1个1号管，两个2号管）配平，放入离心管中，离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶，放入三角烧瓶中，继续消化（注意控制温度，达34℃时计时）。

10．消化到4次左右，吹打均匀后，吸一滴滴在载玻片上，拿到镜下观察消化情况，决定消化次数。

11．离心2次的吸管，放在试管架上，待离心过程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精确，大致这样）DMEM液，记住共加入多少DMEM液的量，换吸管（3号）把各管底细胞块吸下吹打均匀后，移入50ml烧杯中，然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中，加入小牛血清及抗生素，换吸管（4号）吹打均匀。

12．取出24孔培养板，一个人吹打，另一个人用加样器加药。封盖时过火，盖上盖，放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。

（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液时每孔加1~1.5ml）。

三、配药

天平、量筒、烧杯、玻璃棒、二蒸水、硫酸纸。

NE：加样器 1000μL 大头一个或1ml注射器一个，50μL小头一个。量筒100ml，烧杯100毫升。

配法：抽取0.85mlNE液，放入烧杯，再加二蒸水99.15ml补足至100ml，备用。在工作台内，用针头滤器滤过（仪器：针头滤器及膜，先试膜，再高压消毒，注意压力），在一个新的100ml烧杯内。取4个50ml的烧杯，分别标号1、2、3、4。然后用加样器（100μL）分别取0.1mlNE放入3、4杯内。

小牛血清：先配初液，即0.4ml/10ml（用低糖DMEM配，0.4ml牛血清需500μL加样器一个）。配成后即为4％的浓度。分别取0.1ml放入1、2、3、4号的 50ml的烧杯内。

抗生素：分别取0.1ml放入1、2、3、4号的 50ml的烧杯内。

分别向1、2、3、4号的 50ml的烧杯内加入DMEM。各为9.7ml、9.7ml、9.6ml、9.6ml。用4个吸管吹打均匀，然后用加样器每组加1.0ml。另一人用吸管吸出培养液。每组换一个大头。

吡格列酮：取吡格列酮0.2克，溶于2ml甲醇中，针头滤器滤过用，二蒸水稀释至5ml，分别取0.2ml加入50ml烧杯内。

最后，在各个烧杯内配至10ml水平。

小牛血清：先配初液，即0.4ml/10ml（用低糖DMEM配，0.4ml牛血清需500μL加样器一个）。配成后即为4％的浓度。分别取0.1ml放入1、2、3、4、5、6、7、8号的 50ml的烧杯内。

抗生素：取初液1ml，分别取0.1ml放入1、2、3、4、5、6、7、8号的 50ml的烧杯内。

NE：用加样器（100μL）分别取0.1mlNE放入3、4、7、8杯内。

吡格列酮：取吡格列酮0.2克，溶于2ml甲醇中，针头滤器滤过用，二蒸水稀释至5ml，分别取0.2ml加入5、6、7、8烧杯内。

1、3、5、7号低糖，2、4、6、8号高糖。