正常大鼠肺泡上皮细胞的培养

实验材料：

1. 正常大鼠的肺组织；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 肺泡灌洗液Ⅰ：140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2.5 mmol/L磷酸缓冲液、10 mmol/L HEPES、6 mmol/L葡萄糖和0.2 mmol/L EDTA。用无菌双蒸水配制，pH7.4，肺泡灌洗液使用时须预温到37℃；

4. 肺泡灌洗液Ⅱ：在灌洗液Ⅰ中加入2.0 mmol/L CaCl2 和1.3 mmol/L MgSO4，混匀备用。肺泡灌洗液使用时须预温到37℃；

5. 酶消化液：0.25%胰蛋白酶溶液和0.1%胶原酶溶液的混合液；

6. 细胞分散液：100μg/ml的DNAasc和4%的胎牛血清；

7. 培养基：多选择DMEM，配制时添加10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素；

8. 大鼠IgG：用于包被培养器皿。临用前以50 mmol/L的Tris缓冲液（pH9.3）稀释配制。用大鼠IgG包被培养皿的方法如下：

①用50 mmol/L的Tris缓冲液稀释配制鼠IgG（0.5—1mg/mL），均匀地滴加在直径为10cm的培养皿中；

②在37℃温箱中处理4—6h。用灌洗液Ⅱ洗3次。最好用无血清DMEM洗1次，备用；

9. 培养器具：不锈钢网筛（80目、200目和280目）、培养皿或瓶、手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊，止血钳，无菌消毒手术器械；

实验方法：

1. 取雄性Wistar或SD大鼠，体重180—200g。腹腔麻醉，注射3%戊巴比妥钠10mg/kg和肝素400U/kg。无菌条件下剖胸，切开气管插管，动物放血致死；

2. 经气管插管肺内通气数次，至肺呈苍白色（注意通气压不可过大，以免将组织吹破）；

3. 整体取出心、肺和气管，并用肺泡灌洗液Ⅰ经插管肺内灌洗4—6次（每次5ml）。再用肺泡灌洗液Ⅱ灌洗2次；

4. 肺内灌注（消化液）0.25%胰蛋白酶溶液和0.1%胶原酶溶液的混合液。37℃水浴消化15—30min。每隔3—5min后添加消化液；

5. 去除心脏、气管及肺门周围的结缔组织，在5min内快速将肺组织剪成1—2mm3 大小的组织块；

6. 加入总量为4ml的细胞分散液，以终止消化，并将聚集成团的细胞分散；

7. 将切碎的肺组织块倒入三角烧瓶内，用灌洗液Ⅱ补足至20ml，37℃水浴条件下晃动5min（130次/min）；

8. 悬液经80目、200目和280目不锈钢网筛过滤；

9. 收集滤液，放入10ml尖底离心管中，以400r/min离心8—10min；

10. 弃上清液，用DMEM培养液悬浮细胞；

11. 将8—10ml细胞悬液加到用大鼠IgG包被的培养皿上，在37℃、5%CO2 的培养箱中孵育3h；

12. 收集细胞悬液，以400r/min离心8—10min后，弃上清液，再用无血清DMEM漂洗1次。

13. 用20%胎牛血清DMEM悬浮细胞，并进行细胞活力鉴定；

14. 将上述悬液的细胞计数后，调节细胞密度。按1×106 —3×106个/cm3的细胞密度接种于培养瓶或培养板中。放37℃、5%CO2 的培养箱中培养。培养24小时后换液，去除未贴壁细胞后继续培养，以后每周换液2—3次