血清补体总活性测定

1、原理 补体能使抗体致敏的羊红细胞发生溶血反应，根据溶血程度可测定补体总活性。以溶血百分率作纵坐标，相应的血清量为横坐标绘图，可知在50%溶血附近补体的量与溶血程度呈直线关系。因此以50%溶血作为终点较以100%溶血作为终点更为敏感。故称为50%溶血试验，即CH50（50%complementhemolysis）。

2、主要试剂

（1）绵羊红细胞（sheepredbloodcell，SRBC） 自绵羊颈静脉采血，注入装有等量或二倍量阿氏（Alsever）液的无菌三角烧瓶中，轻摇3-5min，分装，4℃保存，可用2-3周左右。试验时，取一定量的SRBC用生理盐水洗涤3次，最后1次洗涤离心的条件每次试验要保持一致。试验时一般配成1×109SRBC/ml。为使每次试验时SRBC的浓度标准化，可根据经细胞计数器校准的浓度为1×109SRBC/ml的细胞悬液，用分光光度计测定其OD541nm值，以后每次试验均参照此OD值校正SRBC浓度；

（2）溶血素（hemolysin） 即抗SRBC抗体，是以SRBC作为抗原免疫家兔所得。有商品出售，可按标示效价计算单位和稀释使用，也可自行制备和滴定；

（3）稀释液

三乙醇胺（TEAE）缓冲液（储存液）：TEAE 28ml，1mol/LHCl 180ml，NaCl75g，MgCl2·6H20 1g，CaC小2H20 0..2g，硫柳汞0.1g，或NaN3 0.5g，用蒸馏水溶至1000ml。放4℃冰箱保存备用；

应用液：取TEAE储存液1份，加蒸馏水9份稀释即成；

（4）致敏SRBC 取2个单位的溶血素与1X109SRBC/ml悬液等量混和，放37℃水浴30min。温育过程中应经常摇动。致敏后用TEAE缓冲液洗涤3次后，制成5X10u/ml浓度的致敏SRBC悬液。

3、方法

先配制50%溶血标准管，在各试管中加入反应物，放37℃水浴60rain，以2000r/min离心10min；再与50%溶血标准管比较，观察溶血程度。

取与50%溶血标准管相接近的二管在分光光度计上分别读取OD541nm值，以最接近50%溶血标准管OD值的一管，按下列公式求得50%溶血的总补体活性值。血清总补体活性（CH50）=1/（血清用量×稀释倍数）。本法测得血清总补体活性的正常值为30～40CH50U/ml。

上述补体总活性CH50测定方法由于每次试验需使用新鲜SRBC，细胞与细胞的批间差异也常因动物的个体和采血时间而异，且又是一种半定量的人工操作试验，迄今难以令人满意。1995年日本学者Yamamoto等创建一种脂质体均相免疫溶破试验，用于血清总补体活性测定。并由Wako公司研制成诊断试剂盒，包括两种试剂：试剂1为脂质体，它是由一个极性部分（磷脂中的胆碱）和一个非极性部分（磷脂中的烷基）组成的封闭性颗粒。在脂质体的内部水相中包入水溶性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）；在其脂质体双层内包裹抗原——二硝基苯酚（DNP）。试剂2为羊抗DNP抗体和酶底物——24mmol/L 6·磷酸萄萄糖（G6P）和9mmol/LNAD（辅酶1）。

试验方法分为两步：

（1）将10ml血清样品与250pL脂质体（试剂1）混合，作用5min；

（2）加入抗体和酶底物（试剂2）125ml，混匀。反应4.5～5min，用自动分光光度分析仪340nm波长测定酶反应物的吸光度。反应过程为试剂2中的抗DNP抗体与脂质体上的抗原（DNP）结合，形成抗原—抗体复合物，血清样品中的补体被激活，攻击并破坏脂质体的膜。脂质体膜溶破后释放出的G-6-PDH与酶底物的G6P和NAD发生反应，产生的NADH在340nm测定其吸光度（A）。A值与血清样品中补体活性成一定比例关系。该法与经典的CH50溶血法对比测定结果的相关系数为r：0.87-0.923，且方法简便，快速准确，血清用量少，适用于自动分析仪测定。