RNAi基础知识介绍

Rnai

最近由于RNA 干扰（RNA interference，RNA i）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNA i领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA 干扰是由长的双链RNA 分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA 。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA 的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA 分子（small interferingRNA s，siRNA s）掺入RNA 诱导的沉默复合物（RNA -induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA 。

这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA 分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA 可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNA i技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNA i的性能明显较高。

有趣的是，除了短双链RNA ，短发夹RNA （short hairpinRNA ，shRNA ），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA ，从而产生RNA 干扰（6、7）。这使得构建表达干扰RNA 的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（4、8）。shRNA 可以利用RNA 聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA （small nuclearRNA ，snRNA ）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1RNA （11）转录的。另外一种办法是两段短RNA 分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA 表达使对功能缺失（loss-of-）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象（11）。

另外一种延长siRNA 抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA 进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA 在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA 的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷（14）。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA 、3'端为4个甲基化核苷的siRNA 与序列相同但是未经修饰的siRNA 比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA 中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA 活性下降。

RNA 干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA 的质粒注入老鼠的尾静脉（15、16）。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA 干扰实验（17）。注射siRNA 之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA 和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA 处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。

上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA 干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA ，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA 的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA 的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA 聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA 载体打开了大门。

总的来说，siRNA 的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA 引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA 干扰引起的严重副作用。因为用siRNA 使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。

总结

经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA 是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA （这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA 分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。

RNA 干扰

RNA 干扰（RNA interference,RNA i）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-strandedRNA ，dsRNA ）诱发的、同源mRNA 高效特异性降解的现象。近几年来RNA i研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNA i技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

1RNA i的发现

RNA i是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA （antisenseRNA ）的过程中发现的，由dsRNA 介导的同源RNA 降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA （senseRNA ）和反义RNA 均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA 技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA 抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA 中污染了微量dsRNA 而引发，并将这一现象命名为RNA i。

此后dsRNA 介导的RNA i现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默（posttranional gene silencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA 介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNA i在不同物种的表现形式。

1999年，Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA 中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA 通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA （small interferingRNA ，siRNA ）引发RNA i。

2000年，Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA 能引发RNA i效应。2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA 可在避免激活dsRNA 依赖的蛋白激酶(dsRNA -dependent protein kinase，PKR)和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylate synthetase，2',5'-OAS)信号转导途径的同时，有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。

2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA （small hairpinRNA ，shRNA ）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNA i技术进行基因治疗研究奠定了基础。

2RNA i的应用

2.1RNA i在探索基因功能中的应用：人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在RNA i技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNA i技术可以利用siRNA 或siRNA 表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA 表达文库构建方法的建立，使得利用RNA i技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。

2.2RNA i在基因治疗领域中的应用：RNA i作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNA i技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA 或shRNA 表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。

3RNA i在整形外科领域的应用前景

已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNA i技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。

最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNA i干扰技术剔除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。

瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，目前尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA 剔除TGF-βII型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF表达可使皮肤成纤维细胞内I型和III型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of lloproteinase，TIMP）-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-β信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。

综上所述，RNA i技术不仅在黑素瘤、乳腺癌等恶性肿瘤基因治疗中有较好的应用前景，而且在肿瘤和瘢痕疙瘩治疗靶点的高通量筛选过程中有较高的应用价值。

SiRNA

Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。

ShRNA

shRNA 短发夹RNA

shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

在活体中输送“短干涉RNA”（siRNA）的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进一种腺病毒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”（shRNA），并被RNAi通道处理。然而，对成年小鼠肝脏中shRNA的表达的长期效应所做的一项研究为我们敲响了警钟。该研究结果表明，很多shRNA在小鼠中表达时是有毒的。这种经常是致命的毒性似乎是由shRNA与内生微RNA之间为与Exportin-5结合所展开的竞争造成的。Exportin-5是一个参与将分子输送出细胞核的因子。人们对开发基于shRNA的疗法非常感兴趣，而此前几乎没有证据表明shRNA在活体中有很强毒性。

RNA组学

对细胞中全部RNA分子的结构与功能进行系统的研究，从整体水平阐明RNA的生物学意义即为RNA组学(RNomics)的主要任务。

国外在2000年底提出了RNA组学。RNA组学研究将会在探索生命奥秘和促进生物技术产业化中做出巨大贡献。如果说基因组学研究正全力构筑生命科学基石的话，那么RNA组学研究则是它不可缺少的同盟军。

美国《科学》杂志在2000年12月介绍2000年重大科学成就时,把人类基因组工作草图绘制工作排在第一位。介绍了生命可能始于RNA而非DNA[1]，这方面的研究取得了突破性进展。

中、美、日、德、法、英六国科学家和美国塞莱拉公司于2001年2月12日联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。人类基因组共有3万至3.5万个基因，其中蛋白质合成的有关基因只占整个基因组的2%[2]。由此产生疑问：①如果一个基因编码一个蛋白质的话，这么少的蛋白质如何维持人体那么复杂而多变的生命现象？②如果一个基因可以表达出多种蛋白，生物又是如何做到这一点的？③不编码蛋白质的98%的基因组有何功能？RNA和RNA组学研究可以提供部分解答。

传统观念认为：三类最重要的生物高分子化合物中，DNA携带遗传信息，蛋白质是生物功能分子，而RNA在这二者间起传递遗传信息功能（即参与蛋白质的生物合成）。20世纪80年代初，T．Cech发现RNA也可成为生物催化剂，他称之为核酶(ribozyme)。在酶学领域，核酶的发现打破了多年来"酶的化学本质就是蛋白"的传统观念。在RNA领域这一发现对传统观念的冲击更大。它使人们认识到，RNA的生物功能远非"传递遗传信息"那么简单。此后，RNA领域的新发现不断出观。1、RNA控制着蛋白质的生物合成；2、RNA具运动功能；3、RNA具调控功能；4、RNA调控遗传信息；5 、RNA修饰；6、RNA携带遗传信息；7、RNA与疾病的关系；8、基因组研究中的"垃圾"可能是RNA基因。

国外在2000年底提出了RNA组学的全新概念。RNA组学研究将会在探索生命奥秘中和促进生物技术产业化中，做出巨大贡献。如果说基因组学研究正全力构筑生命科学基石的话，那么RNA组学研究和蛋白质组学、生物信息学等都是它的不可缺少的同盟军。

研究热点RNA干扰技术、RNAi(RNA干扰)研究程序、合成SiRNA(小干扰RNA)及其基础理论和应用研究。