过氧化氢处理细胞后对目的蛋白提取的影响

DXY网友molihua505提问：这两天做的western，细胞用过氧化氢处理后再提的蛋白。过氧化氢引起细胞损伤，有一些死细胞，我又把培养基中的死细胞离心取沉淀了。 发现浓度较大的组，目的蛋白减少和对照组相比变化不怎么明显，而相对应的actin（肌动蛋白）却比对照少了许多，想问过氧化氢能使actin减少吗，导致过氧化氢处理后内参不应该再用actin了？这是怎么回事啊？

DXY网友yangea回复：首先楼主的操作把培养基中的死细胞离心取沉淀这步是不可取的，在提取细胞总蛋白做western时，应该首先用冷PBS将死细胞漂洗掉。其次，选择内参的原理是其中多数为管家基因，在所有组织中表达较恒定，受外界干扰较小。所有以它们的量为标准，采用归一化处理的方法就可以比较其他蛋白的变化了。actin是细胞骨架蛋白，就具有上述特点。但这种表达的恒定性和受外界干扰小的特性也是相对的。楼主应该参考文献看过氧化氢是否对actin有明显的影响。最后，楼主在做这种半定量western时，是否考虑先对提取的细胞总蛋白大概定个量，以尽量减少上样的差异。

DXY网友Miya回复： 我到是认为并不是细胞作用过氧化氢导致actin表达下降，而是过氧化氢导致目的蛋白表达升高了。因为有死细胞，所以在抽提蛋白的时候，过氧化氢处理组得到的总蛋白量要比对照组低，而actin作为内参理应要低于对照组。而你的目的蛋白处理组和对照组表达差异不明显，如果你扫下蛋白条带的光密度值，用目的/内参得到的值来比较会看得比较清楚。

当然如果楼主怀疑过氧化氢会对Actin的表达产生影响的话，那还是对总蛋白定一下量比较好。或者做考染，看看总蛋白的量是否本来就有区别，还是由于对actin的影响导致的区别。

楼主回复：谢谢以上两位老师的指点，听师姐的建议我昨晚又把膜strip后做的erk，结果还是浓度大的条带淡，应该是我上样量不一致所致。刚提出蛋白来的时候，我本想用考兰G250测浓度的，但开始两个蛋白浓度竟是负值，也不知还是因为仪器坏了，我就没有测。估计着对照组上15 μl，浓度大的上了25 μl，0.75的梳子。立春红预染就发现条带有深浅了。师姐说可以根据显影后条带的浓淡调整上样量，浓度大的组25 μl已经比较极限了，就把其他的上样量降下来，保持actin尽量一致。