DTT特性与保存及其在蛋白纯化和保存中的作用

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DTT( 二硫苏糖醇)是实验室常用的还原试剂，常被用于蛋白质保存以及蛋白二硫键的还原。DTT的入特点是极易被氧化，稳定性较差，一般DTT常保存于-20度中可以长达数年。

DTT是一种很强的还原剂，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环(含二硫键)的构象稳定性。它的氧化还原电势在pH为7时为-0.33伏。

DTT特点与DDT的保存

DTT是一种常用还原剂，有抗氧化作用，进口分装。DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近。但DTT价格略高一些。DTT粉末的一般保存条件：-20℃保存。1M DTT溶液可以在-20℃保存2年以上。

由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差;但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的有效还原性也随之降低;而Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl(TCEP盐酸盐)可以作为低pH值条件下DTT的替代品，而且也比DTT更为稳定。

应用：

DTT的用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在存在氧气的情况下。这种二聚化大大降低了一些偶联反应实验(如DNA在生物感应器中的固定)的效率;而在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除去，就可以降低DNA的二聚化。

DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子 内或分子间二硫键。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部(溶剂不可及)的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性(高温加热或加入变性剂，如6M 盐酸胍、8M 尿素或1% SDS)。反之，根据DTT存在情况下，二硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。

DTT在蛋白纯化 和保存中的作用

我们知道Cys存在与许多蛋白中，且其中的-SH常作为活性中心发挥作用，或者，两个-SH连接成二硫键，是维持蛋白质高级构象重要桥梁。-SH具有很强的还原性，溶液被溶液中的溶解氧或其它氧化物氧化，从使蛋白失去活性。所以，在蛋白纯化 和保存时，在溶液中加入一定量的DTT，以免蛋白-SH被氧化而失活。但这里就有一个矛盾，DTT该加多少量，以使-SH保持还原状态，而使二硫键免遭还原?除了上述作用，DTT还有哪些方面可以起到作用?

我也曾听一高人说起过，以摩尔数计算，5-10倍的量来保护-SH。如果蛋白报存buffer中含有15%左右的甘油，对蛋白具有很好的稳定作用。补充一点：如果dtt和蛋白摩尔比例比例增大到1：100，DTT就能破坏2硫键了，这时对应的浓度一般在10mM左右，这个一般在做还原肽图的时候用到。

不过有些分子 内的二硫键由于空间位阻的作用，还原剂的量增加到很大也不能破坏。这时可能要配合尿素等变性剂才能彻底打断二硫键(如包涵体变性)

DTT在离子状态才有作用，在pH7-9.5的时候作用最强，pH降到3以下几无电离，因此可以通过降低pH至3以下来终止DTT作现在才知道DTT作用还受到pH的影响。提到尿素变性，要是蛋白存在分子 间或分子内二硫键，即使具有高浓度的尿素或盐酸胍，而没有DTT等还原剂，那是否也不能使蛋白完全变性(断裂二硫键)?

我记得有篇“从纯化到星辰”文章中提到“万金油”配方是这样的:

50mM Tris pH 7.9

0.5mM EDTA

50mM NaCl

5% glycerol

DTT断裂二硫键需要什么的条件?蛋白的二硫键断裂后，形态、功能等发生怎样的改变?

我不是专门搞生化的。只是知道点皮毛而已，就我了解的而言，western blot要得以进行，特别是抗体要和目的蛋白结合，一方面要使打开蛋白质的SS键，因为如果SS键不打开，很有可能抗体不能很好的识别特定的位点，就不能结合上去;另一方面还要用SDS-PAGE消除蛋白质分子内的各种非共价键，使蛋白质所带电荷和其分子量成正比，这样才能使蛋白质分离出来。

DTT在电泳中还有一个作用。过量DTT能打开多聚体内的二硫键，使呈各个单体状态，而在loading中去除DTT后，多聚体仍然保持原状态。因此两者对比可以分辨该蛋白是否含有多聚体形式。

结合我的实验，我做的是有关纤维素酶基因的克隆与表达。应用的是家蚕杆状病毒表达系统。

携带有纤维素酶基因片段的重组病毒构建好以后，将转染细胞所获得的达到一定滴度的重组病毒从皮下注射到家蚕体内。

家蚕血淋巴中是否能表达纤维素酶?这是我目前所研究的重点。难点以及疑惑：家蚕血淋巴在空气中容易被氧化，虽然低温下可保持短时间内不被黑化(即氧化)，但测酶活的时候需要经过50度反应30分钟这一步，所以我第一次做的时候由于没添加巯基乙醇或者DTT，所以溶液变黑了。

小结： 本文总结了DTT特点与DDT的保存、应用、DTT在蛋白纯化和保存中的作用。