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单核细胞分离原理、方法及要点

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基本原理:

本文分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法,主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作,且使用通常的实验设备即可完成。

试剂与器材

1)外周血单个核细胞

2)1×PBS和10×PBS(无Ca2+、Mg2+,0.5mM EDTA),胎牛血清(56℃,30分钟加热灭活),HCl 1mol/L。

Percoll分层液(密度=1.130g/ml,商品),4g/L台盼蓝染液(溶解在PBS液中)。

3)50ml聚丙烯圆锥管,毛细吸管,移液管(1、2、10ml)。

4)CO2孵箱,超净台,有旋转桶转子装置的离心机,PH计。

操作步骤——所有的操作应该在无菌条件下进行

(一)不同密度Percoll分层液的配制

1.Percoll分层液储备液的制备:取未稀释的Percoll原液(从瓶中取)9ml+1ml 10×PBS (无Ca2+、Mg2+),用HCl 调节PH至7.4

2. Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)的配制:取Percoll储备液3.12 ml(前一步配制)+1.88 ml 1× PBS1(无Ca2+、Mg2+)

3. Percoll分层液 (Ⅱ)(密度=1.069g/ml)的配制:取Percoll分层液(Ⅰ)2.68 ml+2.32ml 1×PBS( 无Ca2+、Mg2+)

4. Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)的配制:取Percoll分层液(Ⅱ)2.32 ml +2.68 ml 1×PBS(无Ca2+、Mg2+)

(二)不连续密度梯度制备

1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液(Ⅱ)(密=1.069g/ml),后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)

2. 20℃,在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟(慢慢增加速度,无制动停转)。

(三)单核细胞的分离

1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液(Ⅱ)和(Ⅲ)(密度较小的部分)之间的界面中。

2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。

3. 用含1-5%胎牛血清的 1×PBS液洗涤细胞3次,4℃,400×g离心5分钟,弃上清液。

4. 若需要进一步实验,将细胞重新悬浮于培养基中。

5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。

结果:本法回收的细胞中单核细胞占70-100%(存活率应大于90%),淋巴细胞占0-20%,粒细胞占0-5%,红细胞占0-7%,血小板小于0.5%。

实验要点

1.为了得到较好的结果,外周血单个核细胞分离后应立即使用。

2.所有操作过程应在18-20℃中进行。

3.仔细覆盖各种Percoll分层液,避免破坏其界面。

4.洗涤分离细胞3次,以除去残存的Percoll分层液和血小板。

5.如果所制备的细胞仍不纯,可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠, 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。

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