单核细胞分离原理、方法及要点

基本原理：

本文分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。

试剂与器材

1）外周血单个核细胞

2）1×PBS和10×PBS（无Ca2+、Mg2+，0.5mM EDTA），胎牛血清（56℃，30分钟加热灭活），HCl 1mol/L。

Percoll分层液（密度=1.130g/ml,商品），4g/L台盼蓝染液（溶解在PBS液中)。

3）50ml聚丙烯圆锥管，毛细吸管，移液管（1、2、10ml）。

4）CO2孵箱，超净台，有旋转桶转子装置的离心机，PH计。

操作步骤——所有的操作应该在无菌条件下进行

（一）不同密度Percoll分层液的配制

1.Percoll分层液储备液的制备：取未稀释的Percoll原液（从瓶中取）9ml+1ml 10×PBS （无Ca2+、Mg2+），用HCl 调节PH至7.4

2. Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll储备液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml 1× PBS1（无Ca2+、Mg2+）

3. Percoll分层液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml 1×PBS（ 无Ca2+、Mg2+）

4. Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml 1×PBS（无Ca2+、Mg2+）

（二）不连续密度梯度制备

1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液（Ⅱ）（密=1.069g/ml），后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）

2. 20℃，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟（慢慢增加速度，无制动停转）。

（三）单核细胞的分离

1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度较小的部分）之间的界面中。

2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。

3. 用含1-5%胎牛血清的 1×PBS液洗涤细胞3次，4℃，400×g离心5分钟，弃上清液。

4. 若需要进一步实验，将细胞重新悬浮于培养基中。

5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。

结果：本法回收的细胞中单核细胞占70-100%（存活率应大于90%），淋巴细胞占0-20%，粒细胞占0-5%，红细胞占0-7%，血小板小于0.5%。

实验要点

1.为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。

2.所有操作过程应在18-20℃中进行。

3.仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。

4.洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。

5.如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠， 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。