如何获得稳定的细胞株

tydyhan：

我一直做细菌这块，对病毒操作不是很懂，请教大家：

建立表达某基因的重组逆转录病毒载体的B16细胞系

含某基因的重组逆转录病毒载体已获得，需转染PA 317包装细胞，通过G418筛选获得表达某基因的重组逆转录病毒。Polybrene进行转染B16细胞，筛选阳性转化克隆，获得稳定表达的B16细胞株。这里怎么具体进行操作??

丁香园网友adychen认为：

１、首先最好选择的是带ＥＧＦＰ逆转录病毒载体，方便以后的转染率和感染率的观察．

２、重组载体；

３、得出载体抗性基因的抗生素最佳细胞筛浓度，比如说，你用的是ＰＬＥＧＦ载体，抗性为Ｇ４１８，按不同的浓度检测如：200μg/ml、400μg/ml－－－－１２００ug/ml共６个梯度，细胞量最好的１０００Cell/ml，以１０－１４天最低浓度至全部细胞死亡为最佳浓度，我用的是ＰＴ６７最佳浓度为８００ug/ml

4、转染，观察２４－４８h的转染情况，如达４０%以上，可加入Ｇ４１８筛选，３－５天换一次带药的培养液，一般在１５天即可，具体还看转入不同基因可以有差异，得到较高带ＥＧＦＰ的细胞。

５、扩大培养，收集上清。

６、收集到的上清可以做密度梯度离心浓缩病毒。分装冻存在-80Ｃ冻箱里。

７、病毒滴度检测，按以上３的方法，筛出Ｂ１６最低全部细胞死亡浓度，把病毒液稀释成（０、－１、－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０）梯度，分别感染同等量１０００cell/mlＢ１６细胞。以全部细胞死亡的最高稀释倍数为最终病毒滴度。

８、以最佳滴度感染Ｂ１６，并在２４－４８h　观察感染率，４８h 后加入Ｇ４１８筛选。历程一般要１－２个月。