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荧光原位杂交技术

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荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术(florescence in situ hybridization,FISH)是一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性及直观性和原位杂交的高特异性结合起来,通过荧光标记的核酸探针与待测样本核酸进行原位杂交。在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数,从而对染色体或基因异常的细胞和组织样本进行检测和诊断,为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。自20世纪80年代末,Pinkel和Heiles将FISH技术引入染色体检测领域以来,FISH技术在临床诊断及科研工作中得到广泛运用,并显示出比传统技术的显著优势性。1986年.Dilla等首次用荧光素直接标记DNA探针检测人特异性染色体。接着Pinkel等利用生物素标记DNA探针,建立了间接荧光原位杂交技术,这一技术放大了杂交信号。提高了FISH的敏感性。

此后,地高辛和二硝基苯酚等标记物以及各种不同颜色荧光素在FISH技术中被广泛利用,不断完善了该技术的信号检测系统。PCR技术与FISH的巧妙结合,不仅提高了制备探针的能力,也提高了该方法的敏感性,可用于鉴定任一目的基因在染色体中的定位。计算机图像分析技术在FISH中的应用极大地提高了FISH技术的敏感性以及结果的直观性和可信度。FISH技术还可与流式细胞术、染色体显微切割等技术结合使用,使该技术不仅用于细胞遗传学的基础研究,也越来越广泛地应用于肿瘤细胞遗传学研究、遗传病基因诊断等临床医学研究中。
FISH有直接法和间接法两种。直接法是用已知碱基序列的特异DNA片段作为探针,并标记上不同荧光素,在组织切片、间期细胞及染色体标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交。因所形成的杂交体带有荧光素。故可在荧光显微镜下直接观察。

常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红(Texasred)、罗丹明(rhodamine)及其衍生物四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRIT)等。该方法简单快捷,但信号较弱.敏感性较低。间接法使用非荧光物质标记的探针。如生物素或地高辛等标记探针,再通过亲和连接或免疫反应带人荧光物质来检测杂交体的存在。因为有杂交信号放大作用,从而增加了杂交的敏感性。也降低了实验成本。故间接法FISH是目前使用较多的方法。
FISH实验操作与用非荧光标记探针的原位杂交基本相似。在组织准备方面,以新鲜组织、冷冻组织样本、细胞涂片、培养细胞爬片及中期染色体等材料进行FISH的结果优于石蜡包埋组织样本的杂交效果。由于FISH是DNA-DNA原位杂交,故在杂交前的变性处理颇为重要。
近年来。在FISH技术的基础上发展起来的分子遗传学新技术不断出现,如多色FISH技术、染色质纤维荧光原位杂交(chromatin fiber FISH)和DNA纤维荧光原位杂交(DNA fiber FISH)技术等。多色FISH通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合(直接法),在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜色标记,同时检测多种染色体异常。

如许多用染色体涂片方法和G或Q显带技术无法检测或难以确定的染色体异常,通过多色FISH技术可以揭示染色体畸变,并确定畸变的来源。此外,多色FISH对于复杂的染色体核型改变。尤其是实体瘤的染色体检查具有很好的临床应用价值。多色FISH也可采用三种或三种以上不同的标记物。如生物素、地高辛和二硝基苯酚标记探针,然后用不同颜色荧光素,如FITC(绿色)、罗丹明(红色)和cascadeblue(蓝色)标记抗体进行检测(间接法),可同时得到多种不同颜色的荧光信号,这种方法可以在同一标本上同时检测多种DNA序列。
纤维FISH技术是将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维,然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交,最后用荧光显微镜观察结果并分析,若配合计算机图像分析软件使用,结果会更理想。纤维FISH技术可以快速直接目视判断探针位置以及多个探针间的相对位置、物理位置和重叠程度等,因而大大加速了基因定位和人类基因组高分辨物理图谱的绘制。
PRINS技术是将PCR和FISH技术联合使用,先由寡核苷酸引物或变性DNA片段与细胞内的靶DNA互补序列复性。在聚合酶的作用下,将荧光标记的脱氧核苷酸(如FITC―1l―dUTP)带人新合成的DNA中。PRINS技术可用于检测罕见的异染色质变异体和评价肿瘤细胞株的染色体异质性。

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