材料与仪器
步骤
一、材料和试剂
1 精 液 涂 片 的 制 备
（1）3〜9uL 新鲜或冷 冻 的 精 液（见 注 释 1)。
（2） 有磨砂末端的玻璃载玻片。
（3） 1 0 0 % 乙醇。
2 精 子 的 去 浓 缩
（1）染色缸中加入 40 mL 二 硫 苏 糖 醇（D TT， Sigma-Aldrich， St.Louis, MO) 置于冰上。
（2）染 色 缸 中 加 入 40m L 3， 5-二 碘 水 杨 酸 锂（LIS， Sigma-Aldrich) 置于室温(R T )。
（3）Tris (羟甲基）氨基甲烷盐酸（ Tris-H C l ， Sigma) ; 调 节 p H 至 7. 8。
（4）高压灭菌过的蒸溜水（d H20 ) 。
（5）循环水浴设置到 77〜78°C 。
pH 至 7.0。继续加人水直至体积达到 1()00 mL。过滤除菌，室温保存。
3 人类ACM测定的实验室方法
3.1 精 液 涂 片 制 备
（1） 将玻片在 100% 乙醇中浸泡至少 2 天。将玻片呈十字形分层放人有盖的缸或容器中，以将尽可能多的玻片暴露于酒精中。向缸中注入酒精直至覆盖所有玻片。当移出玻片时，穿着适当的个人防护设备（P P E )，用 Kimwipe 无尘室抹布用力擦所有玻片，然后放人玻片盒中。
（2）用一支钻石笔，从另一张干净玻片中切下一片，宽度要略小于玻片宽度（用另外一张玻片来测量）；标记完表面后，向内掰玻片，小心地使玻片裂开。小心不要碰到将与样品接触的边缘。除此之外，也可以使用盖玻片代替；然而，盖玻片在涂片过程中更容易断裂。操作过程中需穿着合适的个人防护设备。
（3）用移液管吸取 7uL 精液样本于一张干净玻璃玻片上。体积可以根据样本精子浓度 调 整（ 比如 3〜9uL) (对于低精子量捐献者见注释2)。
（4）使用一张预制切割的玻片来涂样本。将磨砂末端持于一手中以使玻片略微倾斜，另一端静止于工作台上，直接将切好的玻片（ 或盖玻片）置于样本滴上方；干净的未触碰过的预制边缘只允许在这一点上与玻片接触。慢慢移动切割玻片盖玻片的边缘使其进入与样本接触；样本会自动顺边缘分布。当样本顺边缘分布后 ，将边缘向磨砂末端拖动，涂抹样本 2. 5〜4c m 。
（5）将涂好的玻片平放在干净纸巾上。样本晾干时，将涂片放入玻片盒中，盖子略打开，让其空气风干至少 24 h 。我们强烈推荐将玻片留置数日（ 见注释 3)。
3.2 A C M 探 针 制 备
这个程序使用随机引物法来为杂交产生标记探针。随机的八聚体与变性的 D N A 模板聚合，并 用 K l e n o w 片段进行延伸。过程
中，荧光标记的 11- d U T P 在 10〜40 倍的放
![下面的量是为4 张玻片杂交所需制备的探针。探针的用量可能需要根据每批探针的 质量进行调整（ 见 3.2.3)。 1. 30/xL 小鼠 Cot-1 D N A (Invitrogen)0 2. 小鼠 2cent-D I G 。 3. 2； xL 小鼠 2tel-bio。 4. IpL 小鼠 8-bio (克隆 4a)。 5. I//L 小鼠 8-bio (克隆 5e)。 6. 0 •5M L 小鼠 8-DIG (克隆 4a)。 7. 0 •5p L 小鼠 8~DIG (克隆 5e)。 8. 2] lxL 緋鱼精子 D N A (Invitrogen)。 9. 4. IfxL 3mol/L 乙酸钠。 10. 112.75/xL 冰冻的 100% 乙醇。 1 . 5 杂交 与 2. 1.5相同。 3 . 1 . 6 杂交后漂洗和抗体染色 1. 循环水浴设定到45°c 。 2. 50% 甲酰胺/2 XSSC: 25mL 甲 酰 胺 （ Shelton Scientific)， 5mL 20 X SSC， IOmL高压灭菌的蒸馏水，然后用2mol/L HCL调 节 p H 至 7. 0 , 并用蒸馏水定 容 到 50mL。 3•2X S S C : 将10m L .20X S S C 用 800m L 灭菌蒸馏水稀释。用 2mol/L H a 调节 p H 至 7.0。再加水至l O O O m L。过滤除菌，室温保存。 4. IOOmL P N 缓冲液。 5•二重探测反应物CL^L 荧光素卵白素DCS; I^L 抗地高辛罗丹明， 498juLPN， 保存于4。〇 。 3 . 1 . 7 复染 与 2. 1.8相同。 3- 2 小鼠CT8 测定的实验室方法 3-2 - 1 附睾精子涂片制备 1-设定培养箱温度为32°C 。 2. 在 I. 5mL的微量离心管中装人3(%L 2. 2%枸橼酸钠，预热到32°C 。 3. 根据关怀和使用实验室动物进行研究的纲要，用 C O 2对小鼠进行安乐死。分离 两个睾丸的附睾尾部。用镊子夹持每个尾部，用虹膜剪在尾部剪一个小孔。小](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1468483520653estx6xmzxnpng_small.jpg)
4.精子 F I S H 测定显微数据收集方案
之前的内容已经描述了 A C M 和 C T 8 测定中制作良好杂交质量玻片的实验室方案。杂交质量，即高度明亮且紧凑的 F I S H 信号和低背景是影响精子 F I S H 研究成功与否的最关键因素。然而， F I S H 信号的显像和为减少技术因素对实验结果最小影响而开发的数据收集方案也同样重要（见 Pacchierotti 和 Sgura，本书，有关费光显微镜和滤光片设定的信息）。接下来的内容中，我们将会着眼于几个精子 F I S H 测定可靠性的关键技术因素，如 ：（1 ) 决定精子是否含有异常斑点数目的严格记录标准的发展； （2 ) 记录员盲态和数据收集的过程；以 及 （3 ) 不同记录员间记录标准的协调（见注释 16)。
4.1 ACM 和 CT8 精子 FISH 测定的记录标准
F I S H 信号的主观评估性是会导致不同实验员和实验室间记录结果的较大差异的问题 。我们研究组投人了大量的努力来发展严格的记录标准，以减少实验员之间的差异。严格执行这些记录标准是产生可重复性数据所必需的。记录标准的第一步是决定一个精子是否应该被记录。被记录下的精子必须满足以下条件（这些条件对人类和小鼠精子都适用）：
（1） 整个细胞必须可见。只计数整个细胞边缘可见的细胞。不要计数部分被其他细胞遮挡的细胞。例如不要计数成大团的细胞，重叠的细胞可能会遮盖突光信号。
（2）细胞必须看来完整。细胞的内容物必须保留在细胞边缘之内。有时候过于去浓缩的细胞会移出核容物或荧光区域，并不适于记录。例如不要计数荧光区域在精子头部主体之外的细胞。
（3） 细胞应在玻片上良好杂交的区域。通常在杂交玻片上，存在有效杂交的整个区域以及非良好杂交的区域。忽略某些杂交不好的区域很必要。
（4）细胞的大小应该不小于 5um 且不大于 15u m 。 一 个有分度线的目镜可用于这个工作。未去浓缩的细胞不能可靠地杂交，为了避免偏倚的数据，分度线上小于5u m 的细胞不包括在分母中。这种细胞的分数保留，但它们的荧光区域不被记录。过于去浓缩的细胞表现非常弥散的杂交信号，也不能可靠地记录。
（5）细胞应该没有背景。玻片上可能会有一些背景信号。一个区域有过高的背景使其真正的信号很难区分，不应该被记录。
只有满足所有条件的精子才可记录它们的 F I S H 表型。下面，我们描述 A C M 测定的决策树和 C T 8 测定的决策树。
4.2 ACM 测定的决策树
在分析 F I S H 信号之前，记录者应该用相差显微镜来评价细胞的轮廓（完整的或溢出的），一个或多个尾部的出现，来决定记录的细胞是否合格。同样，也必须确定是一个细胞而不是两个重叠的细胞。记录时必须满足以下标准：
（1） 整个细胞可见，无隐藏于视野外部分。
（2）细胞边缘看起来完整。
（3）细胞有尾部或尾部附着区（见注释 17)。
（4） 所有的杂交信号都在细胞内。
（5） 用分度线衡量，细胞大小不小于 5 个且不大于 15 个刻度。
（6）细胞处在玻片上大部分细胞良好杂交的区域上。
如果有任何条件未符合，则细胞不适于被记录。如果内容物溢出或细胞过小或过大，此信息应该被计数，但杂交信号不被记录。如果细胞适于记录，下面决策树中的步骤用于决定 F I S H 表型。
4.2.1 Alpha(A ) 和 经 典（Q 探针之间是否有间断？
若要定义为 A 和 C 探针之间的间断必须满足以下条件：
（1）A 和 C 信号必须至少相隔一个 A 信号区域的宽度。
（2）玻片的同一区域上，根据这些探针所要显示的杂交信号，两种信号大小必须都正常。
（3）这些信号必须完全分离，不能有任何线相连。
（4）细胞有尾部或尾部附着区。
（5） 细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 A 和 C 区域中间有间断；否则细胞不被记录。
4.2.2 经 典（C ) 探针内部是否有间断？
若要定义为 C 信号之内有间断，必须满足以下条件：
（1）只有一个 C 信号与 A 信号相连。
（2）如果两个 C 信号同等大小，则其必须相隔一个独立信号的宽度；如果大小不等，则其必须相隔较大的 C 信号宽度。
（3）两个信号必须有大概一致的强度。
（4）信号必须完全分离，不能有任何线相连。
（5） 细胞有尾部或尾部附着区。
（6）细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 C 区域中间有间断；否则细胞不被记录。
4.2.3 任何信号是否有重复或删除？
若要定义为 C 区域的重复，必须满足以下条件：
（1）细胞内的两个 C 信号必须有大概相同的大小。
（2）两个信号必须强度大概—致。
（3）玻片的同一区域上，根据这些探针所要显示的杂交信号，两个信号大小必须都正常。
（4）信号必须相隔至少一个全区域宽度。
（5）信号必须完全分离，不能有任何线相连。
（6）细胞有尾部或尾部附着区。
（7）细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 C 区域中有重复；否则细胞不被记录。
若要定义为 C 区域的删除，必须满足以下条件：
（1） C 信号的缺失必须用特异性针对此种信号的滤光片来确定。
（2） 细胞附近或周围没有碎屑。
（3）细胞未被损伤。
（4） 细胞有尾部或尾部附着区。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 C 区域中有删除；否则细胞不被记录。一个相似的程序用于决定 A 和 M 区域是否有重复或删除。
若要定义为 A C 探针的重复，必须满足以下条件：
（1）每个探针的两个信号必须大概大小相同。
（2）每个探针的两个信号强度必须大概一致。
（3）玻片的同一区域上，根据这些探针所要显示的杂交信号，每个探针的两个信号大小必须都正常。
（4）信号必须相隔至少一个全区域宽度。
（5）信号必须完全分离，不能有任何线相连。
（6）细胞有尾部或尾部附着区。
（7）细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 A 和 C 区域中有重复；否则细胞不被记录。
若要定义为 A C 区域的删除，必须满足以下条件：
（1）A 和 C 信号的缺失必须用三重、单重和 D A P I 滤光片来确定。
（2）细胞附近或周围没有碎屑。
（3） 细胞未被损伤。
（4） 细胞有尾部或尾部附着区。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 A C 区域中有删除；否则细胞不被记录。
4.2.4 细 胞 是 否 为 二 倍 体 精 子 ？
若要定义为二倍体精子，必须满足以下条件：
（1） 有两个 A 信号、两 个 C 信号，以及两个 M 信号。
（2） 每个探针的两个信号必须大概大小相同。
（3） 每个探针的两个信号强度必须大概一致。
（4）玻片的同一区域上，根据这些探针所要显示的杂交信号，每个探针的两个信号大小必须都正常。
（5）每个探针的两个信号必须相隔至少一个全区域宽度。
（6）信号必须完全分离，不能有任何线相连。
（7）细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
（8）细胞确实是一个细胞而不是两个重叠的细胞（这点需用相差显微镜仔细检查）》
如果所有条件都符合，细胞可被记录为二倍体；否则细胞不被记录。
偶尔的，无杂交信号的精子可被看到。在这些情况下，信号的缺失应该用所有的滤光片来确认。另外，还需在相差显微镜下査实，细胞为所要求大小，没有碎屑重叠于镜子上，也没有细胞重叠。以上标准检査通过后，细胞被记录为◦ (表 1)。
4.3 CT8 测定的决策树
在分析 F I S H 信号之前，记录者应该用相差显微镜来评价细胞的轮廓（完整的或溢出的），头部的钩形，以及一个或多个尾部的出现，来决定记录的细胞是否合格。同样，
也必须确定是一个细胞而不是两个重叠的细胞。记录时，必须满足以下标准：
（1）整个细胞可见，无隐藏于视野外部分。
（2）细胞边缘看起来完整。
（3）细胞有钩。
（4）所有的杂交信号都在细胞内。
（5）细胞处在玻片上大部分细胞良好杂交的区域上。
如果有任何条件未符合，则细胞不适于被记录。如果内容物溢出或细胞过小或过大，此信息应该被计数，但杂交信号不被记录。如果细胞适于记录，下面决策树中的步骤用于决定 IrI S H 表型。
4.3.1 2 号染色体的着丝粒区域是否有重复或删除？
若要定义为 C 区域的重复，必须满足以下条件：
（1） 细胞内的两个 C 信号必须有大概相同的大小。
（2） 两个信号必须强度大概一致。
（3）玻片的同一区域上，根据这些探针所要显示的杂交信号，两个信号大小必须都正常。
（4）信号必须相隔至少一个全区域宽度。
（5）信号必须完全分离，不能有任何线相连。
（6） 细胞有钩形。
（7） 细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 C 区域中有重复；否则细胞不被记录。若要定义为 C 区域的删除，必须满足以下条件：
（1） C 信号的缺失必须用特异性针对此种信号的滤光片来确定。
（2） 细胞附近或周围没有碎屑。
（3） 细胞未被损伤。
（4） 细胞有钩形或尾部。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 C 区域中有删除；否则细胞不被记录。
4.3.2 2 号染色体的端粒区域是否有重复或删除？
若要定义为 T 区域的重复，必须满足以下条件：
4.2.5
1细胞内的两个 T 信号必须有大概相同的大小。
2两个信号必须强度大概一致。
3玻片的同一区域上，根据这些探针所要显示的杂交信号，两个信号大小必须都正常。
4信号必须相隔至少一个全区域宽度。
5信号必须完全分离，不能有任何线相连。
6细胞有钩形。
7细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 T 区域中有重复；否则细胞不被记录。
若要定义为 T 区域的删除，必须满足以下条件：
1 信号的缺失必须用特异性针对此种信号的滤光片来确定。
2细胞附近或周围没有碎屑。
3细胞未被损伤。
4细胞有钩形或尾部。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 T 区域中有删除；否则细胞不被记录。
4.3.3 这 个 细 胞 的 2 号 染 色 体 是 否 为 非 整 倍 体 ？
若要定义为 2 号染色体的二体化，必须满足以下条件：
1细胞内两个 C 信号和两个 T 信号必须大概大小相同。
2每个探针的两个信号强度必须大概一致。
3玻片的同一区域上，根据这些探针所要显示的杂交信号，每个探针的两个信号大小必须都正常。
4每个探针的两个信号必须相隔至少一个全区域宽度。
5每个探针的两个信号必须完全分离，不能有任何线相连。
6细胞必须是钩形。
7细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 2 号染色体的二体化；否则细胞不被记录。
若要定义为 2 号染色体的缺失，必须满足以下条件：
1C 和 T 信号的缺失必须用特异性针对每种信号的滤光片来确定。
2细胞附近或周围没有碎屑。
3细胞未被损伤。
4细胞有钩形或尾部。 、
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 2 号染色体的缺失；否则细胞不被记录。
4.3.4 这 个 细 胞 的 8 号 染 色 体 是 否 为 非 整 倍 体 ？
若要定义为 8 号染色体的二体化，必须满足以下条件：
1细胞内两个 8 信号必须大概大小相同。
2两个信号强度必须大概一致。
3玻片的同一区域上，根据这些探针所要显示的杂交信号，两个信号大小必须正常。
4两个信号必须相隔至少一个全区域宽度。
5两个信号必须完全分离，不能有任何线相连。
6细胞必须是钩形。
7细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 8 号染色体的二体化；否则细胞不被记录。
若要定义为 8 号染色体的缺失，必须满足以下条件：
1 8 信号的缺失必须用特异性针对每种信号的滤光片来确定。
2细胞附近或周围没有碎屑。
3细胞未被损伤。
4细胞有钩形或尾部。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为 8 号染色体的缺失；否则细胞不被记录。
4.4 细胞是否为二倍体精子？
若要定义为二倍体精子，必须满足以下条件：
1有两个 C 信号、两个 T 信号，以及两个 8 信号。
2每个探针的两个信号必须大概大小相同。
3每个探针的两个信号必须大概大小一致。
4玻片的同一区域上，根据这些探针所要显示的杂交信号，每个探针的两个信号大小必须都正常。
5每个探针的两个信号必须相隔至少一个全区域宽度。
6信号必须完全分离，不能有任何线相连。
7细胞的周围或细胞内没有杂交信号提示其可能为假象。
8细胞确实是一个细胞而不是两个重叠的细胞（这点需用相差显微镜仔细检查）。
如果所有条件都符合，细胞可被记录为二倍体；否则细胞不被记录。
4.5 细胞内是否无信号？
偶尔的，无杂交信号的精子可被看到。在这些情况下，信号的缺失应该用所有的滤光片来确认。另外，还需在相差显微镜下查实，细胞为所要求大小，没有碎屑重叠于镜子上，也没有细胞重叠。以上标准检查通过后，细胞被记录为〇〇〇（表 2)。
4.6 数据收集
4.6.1 记 录 员 盲 态 及 编 码 过 程
尽管有前面描述的严格记录标准的执行，精 子 F I S H 信号的记录仍然是种主观的分析 ，因此仍有记录偏倚。应该特别保证记录员对所记录原始样本的盲态。很多步骤可以达到这个目标。首先很重要的是，记录员不能单独从精子浓度鉴别出玻片的来源。化学暴露可能会导致精液中精子数量明显减少。在这种形势下，需有一个第三者来特别用心确定玻片上具有最高精子浓度的部分被选用来杂交，这样来自对照和暴露组的样本，其精子浓度不会差别太大。其次，编码需记录玻片的人应该确保所有的实验组和对照组都以一套 5 或 6 张玻片为代表提供给记录者。任何玻片上的标记都应该被擦除，然后将有编码的黏性贴纸贴于玻片的磨砂部分。第三，计数所记录精子数目的方法应该只向记录者提供所记录精子数目的信息，而不应提供已发现了多少 F I S H 表型异常的精子。
我们常规对每个样本记录 10 〇〇〇个 精 子（两次记录，每 次 5000 个精子）。相对短时间内用精子 F I S H 分析大量精子的优点是，对比而言这些测定法有相对高水平的敏感度和统计效能，因此微量的升高可通过分析每个实验组少数几个捐献者的精子被探测出来。如前所述， 5 或 6 张玻片为一套提供给记录者（见注释 18)。一旦记录者完成了对每个编码玻片上 5000 个精子的分析，玻片就返回给编码者，编码者除去贴纸，用一张新贴纸来编第二个号码。每当玻片被重新编码后，就再提供给记录者，其再编码第二套 的 5000 个精子。第一套 5000 个精子的记录通常从盖玻片左边开始，而第二套 5000个精子的记录从右边开始。为了确定玻片上两个独立的部分被记录，用永久性标记笔在玻片边上作标记来指示在哪里停止记录。另外，可以登记下记录停止的定位坐标。如果在第二套 5000 个精子的记录过程中记录者到达太靠近标记处，记录就应该被终止，用来自同一个捐献者 z 动物的另一张玻片来完成第二套 5000 个精子的记录。
4.6.2 用 于 数 据 记 录 的 计 算 机 软 件 Cytoscore®
数据的收集是用 Lawrence Livermore 国家实验室开发的用于追踪记录精子数目和其 F I S H 表型的 Cytoscore® 程序完成的。这种 Cytoscore® 程序允许用户输人除 F I S H 表型以外的其他信息，如精子头部的大小和形状、是否提供第二种意见，以及记录者感觉必要的附加信息（图 2)。对每一套数据， Cytoscore® 创建三个文档： （1 ) 总计，显示总的记录数据。在文档的开头收集了关于数据的信息，汇报了记录者、使用的显微镜、科研项目，以及附加的显微镜设定。随后是分析的精子数目以及异常细胞的数目和类型； （2 ) 分述概要，报告总计所包含的同样的信息；然而，这里的数据报告的是每套5000 个精子的。用这样的方式报告数据可以提供杂交质量的信息。在同质杂交的情况下 ，异常的细胞应被平均分配于不同的分部中。如果情况并非如此，表明玻片上有些区域比其他的要好（或差）。 （3 ) 异常数据，总和报告所有称为异常的细胞及其在玻片上的定位，加上一组附加信息，包括记录者或第二种意见提供者插人的注释。 Cytoscore®软件产生的文档可以输出为 Excel 表格以用于数据分析。此过程的第一步是解码样本,X2 检验来对比来自同一张玻片的两套 5000 个精子。如果对比结果良好，数据计人
研究结果；如果对比不好，例如两套存在较大差异，数据需弃用，玻片必须被重新记录。
4.7 记录员、实验，以及合作实验室间的记录协调
记录协调的目的是建立记录员、研究、实验室间标准的记录规范标准，以使分析的
一致性达到最大程度，并使技术差异达到最小。协调程序的途径是：（1 ) 帮助新的记录员在记录标准（见 4. 2 及 4. 3 ) 描述的条件下建立可视化图像，以 及（2 ) 用确定的异常精子频率的样本进行记录协调试验。
来源：丁香实验
