动物细胞培养技术及hanks液的配制

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细胞生物学生物大实验的时候有关动物细胞培养 的大实验，在这里详细介绍了细胞培养中各种器皿的清晰和灭菌、培养基的配制、hanks液/d-hanks液等试剂的配制、细胞的传代培养及其冻存与复苏方法与操作步骤。

细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养.使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。

细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响;二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。

细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学 、肿痛学及病毒学等

这次的动物细胞培养是一个精细的，需要有步骤、有计划的进行的实验。主要步骤有：1、清洗与灭菌;2、培养基配制;3、Hanks、D-Hanks液和消化液的配制、4、细胞传代培养 ;5、细胞的冻存与复苏。可分几次小实验进行操作。

Ⅰ清洗与灭菌

一、实验目的

能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。

二、实验原理

清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0.1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。

三、实验材料、用品

1、材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0.22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0.22 μm，过滤器(直径25)。

2、药品：70%或75%酒精，0.1%新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0.5%过氧乙酸，乳酸，37%甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水[体积分数0.1%的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。

3、仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。

四、实验步骤

(一)实验器具清洗

l 玻璃类 1、主要有：培养瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，离心管，试管，培养皿等。

2、清洗步骤：

泡在含有洗洁净的自来水中→捞出来用毛刷将实验器具各个面刷洗至少25遍→自来水冲洗25遍→过一遍一蒸水→泡入铬酸,过夜(24h左右)→从铬酸中捞出器具，自来水冲洗25遍→过三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子备用→用前高温灭菌(121℃，25min)→烘干→使用。

注意：新的玻璃器具先要泡盐酸1天，然后清洗步骤与上面相同。

l 塑料类

1 塑料类器具主要包括：孔板，大枪头，瓶盖，滤器，采血管等。

2 清洗步骤：

(1)孔板，采血管

泡在有洗洁净的自来水中→用超声清洗仪超声3遍(每遍1小时，200C)→在含有洗洁净的自来水中用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍→过一遍一蒸水→泡入盐酸过一个礼拜→从盐酸中捞出后自来水冲洗25遍→过三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子→用前包装好照钴→使用

(2)大枪头，盖子，滤器

在含有洗洁净的自来水中用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍→用超声清洗仪超声1遍(每遍45分钟，200C)→自来水冲洗→过三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子→用前包装好灭菌→使用

注意：(1)烘孔板时温度不应太高，烘干后用报纸包裹，装入箱子内，照钴，便可使用。

(2) 新的培养瓶盖子泡旧5%稀盐酸1天→再用2%NaOH煮20min →自来水冲洗→洗洁精清洗→用超声清洗仪超声1遍(每遍45分钟，200C)→冲洗15遍→过三遍一蒸(每遍3次)→过三遍三蒸水→烘干使用

(二)包装与消毒

2、包装

洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。比如小青瓶，试管，移液管，血清瓶，培养瓶，离心管，孔板，枪头，针式滤器等的包装。其中针式滤器包装之前要装好滤膜，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中 。

2.1 包装分类

局部包装：较大瓶皿如细胞培养瓶，烧杯，容量瓶，三角瓶， 消毒筒以及体积较小，但瓶口包装方便的容器如青霉素瓶等的包装，通常采用局部包装。

全包装：体积较小的培养瓶皿，注射器，胶塞及不便局部包装的用具如金属器械等，需采用全包装，现多采用直接装入铝饭盒的方法。用铝饭盒来封装小培养瓶，胶塞和胶帽等很好，但往往因盖不严紧使用期限不宜太长。因铝饭盒不透明，在盖子宜写上用品名称以便于确认，吸管在装入消毒筒之前，先用少许脱脂棉将吸管接口端堵塞，松紧度适宜，过松易脱落，过紧不透气，妨碍使用;然后装入消毒筒中，消毒筒底部应垫以软纸或棉花以防吸管装入时折断管尖;最后再包装入筒中封口。

2.2 注意

包装之前玻璃器皿盖子要拧松。

2、 消毒灭菌概念

消毒 具有杀死致病微生物的作用或方法，称为消毒。通常只能消灭物体表面或环境中的一部分微生物，有能达到消灭所有微生物。

灭菌 指彻底杀菌，即用物理或化学等方法，杀死物体上的一切微生物，以及它们的芽胞和孢子，使物体成为无菌状态。

2.1 消毒灭菌方法

2.1.1 物理消毒灭菌法

通过高潮、射线、微波以及器械进行灭菌或除菌的方法均为物理灭菌方法。

(1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。

(2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90-120 min。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5-8 h。

(3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手动高压灭菌锅操作如下：

①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。

②加热高压锅。将放气阀打开，放气5—10 min，以排除锅内的冷空气。

③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。调节火力大小保持该压力。

④停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。

电热自动灭菌锅使用说明(型号：SANYO Autoclave MLS-3020)：

①放气筒加水至LOW水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后将放气筒归于原位。

②打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于V型凹槽的1/3-2/3处。

③打开电源。

④设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为105-121℃，高压灭菌一般采用121℃20—30 min。

⑤把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将exhaust钮旋至close位置。

⑥关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。

⑦按start钮，开始高压，在温度达80℃时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。当压力降至0 MPa时，蜂鸣器再报警一声。温度降至80℃时，蜂鸣器报警10次。显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。

⑧关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。

(4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。滤膜孔径有0.60 μm、0.45 μm、0.35 μm、0.22 μm、0.10μm等，以0.22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。

①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0.22μm。

②用布包好，湿热灭菌后使用。

2.2.2化学消毒法

常用的消毒液有如下几种：

(1)70%(或75%)酒精：超净台里常备70%酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。

(2)0.1%新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。

(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。

(4)0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。

(5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1—3 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。

(6)37%甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3 d后方可达到消毒空气的目的。

3.煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。

五、注意事项

1.清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。

2.干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。.

3.高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。

4.牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。

5.滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。

6.使用化学消毒法时，配制75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。

Ⅱ、培养基的配制

一、 实验目的

熟练掌握培养基(RPMI1640和DMEM)的配制，了解其他培养基配制方法。

二、 实验原理

组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须得生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10%-20%)。

三、 仪器、材料和试剂

仪器：滤泵一套、滤器一套、蒸馏器、高压灭菌锅、磁力搅拌器。

材料：3000ml锥形瓶、250ml或500ml培养瓶、翻冒塞、饭盒、pH试纸、孔径0.22μm的微孔滤膜。

试剂：盐酸、无离子水、小牛血清、合成培养基(RPMI1640)、青霉素、链霉素、NaHCO3。

四、 实验步骤

(一) 准备和安装滤器

在超净工作台内打开包有清洗灭菌好的过滤器的牛皮纸，并架好。胶管一段接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管伸入到已消毒的瓶子中。用滤泵做正压过滤，压力数字为2。过滤后检查滤膜是否完好无损。

(二) 合成培养基的配制

1、 取3000ml三蒸水，加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间(2-4h)使之充分溶解。

2、 通入适量CO2 或加入6mol/L盐酸调pH至6.0左右。

3、 加入一定量的NaHCO3调节pH至7.0左右。

4、 加水至最终体积。

5、 在超净工作台中对溶液进行过滤除菌，分装入250ml或500ml培养瓶中，用翻冒塞塞紧瓶口。

6、 4℃冰箱储存(可以-20℃储存)。

(三) 小牛血清的处理

市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还要做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。

1、 将血清加热到56℃并保存30min，期间要不时的轻轻摇晃，使受热均匀，防止沉淀析出;

2、 处理后的血清储存于4℃;

3、 小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。

(四) 生长培养基的配制

除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需要加入一定量的小牛血清和抗生素。

1、培养基分装成小瓶(100ml-200ml)以便使用，翻冒塞塞紧瓶盖;

2、按以下比例配制：

基本培养基占80%-90%，小牛血清占10%-20%。

按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使用青霉素和链霉素的终浓度分别是100U/ml和100μg/ml。

五、 注意事项

1、 培养细胞使用的瓶子和饭盒应与提取RNA和培养细菌的瓶子和饭盒严格分开。因为用于处理提取RNA的DEPC水(0.1%焦炭酸二乙酯)是一种致癌物，可能影响细胞生长;而培养过细菌的用品也不应与细胞混用。

2、 过滤时压力不可过大，否则细菌易滤过达不到除菌效果，或使滤膜破裂。分装时需根据使用量的多少选择合适大小的瓶子，并且每瓶只能装2/3体积的液体，过多时瓶子易爆或胶塞自喷。

3、 滤器用毕立即刷洗，过蒸馏水，晾干收藏。

Ⅲ、Hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制

一、 实验目的

熟练掌握Hanks、D-Hanks液等平衡盐溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。

二、实验原理

Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。

胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。本实验室一般用1：250(GRC公司生产)。胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说浓度大、温度高(勿高于37℃)、作用时间长，则对细胞分离能力大。但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力最强。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%或0.2%。用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%。

三、仪器、试剂和材料

材料：3 000 mL锥形瓶，25 mL、50 mL试剂瓶，500 mL输液瓶，螺口盖，翻帽塞，pH试纸，孔径0.22μm的微孔滤膜。

试剂：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚红，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚红(0.1%)(配法：称酚红2 g，置于研磨器中，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加进该5.6%NaHC03溶液使最终体积为100 mL。瓶装保存，备用)。

仪器： 抽滤泵1套，过滤器1套，高压灭菌锅，量筒，磁力搅拌器，研磨器。

四、实验步骤

(一)配制D-Hanks液

1.按表2—3—5称取D-Hanks试剂。

2.依次加入上述试剂至800 mL蒸馏水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高压灭菌，10磅10 min。

(二)配制Hanks液

1.按表2—3—5称取Hanks试剂。

2.称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天时研磨器应放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，调制成糊状。再放入4℃预冷的适量D-Hanks液中，4℃下磁力搅拌使完全溶解。

3.用NaHC03干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右(胰酶作用的最适pH值)，并加入0.02%EDTA以协助消化作用。

4.滤过除菌(方法见二、培养基的配制)，-20℃冻存。

五、注意事项

1.BSS的pH值应确定为7.2左右。

2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100 mL的CaCl2与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免高压灭菌后液体变混。

3.胰酶受热易失活，所以尽量避免盛夏配制，并且在配制过程中温度应始终保持在4℃左右。

4.胰酶研磨要充分，否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉，不能达到真正的浓度。

5.胰酶分装时尽量分装成多瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时体积会膨胀，而多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并可能造成污染。

Ⅳ、传代细胞培养与观察

一、实验目的

熟练传代细胞的传代方法及操作过程。

二、实验原理

传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。

三、仪器、材料和试剂

仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净台

材料：培养瓶、试管、移液管、巴士德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯、培养的细胞。

试剂：培养基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hanks液。

四、实验步骤

1、入无菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒双手;

2、倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否传代及细胞需要稀释的倍数。 将培养用液37℃下预热。

3、超净台台面应整洁，用75%酒精棉球擦拭清洁;

4、打开超净工作台的紫外灯照射台面20min左右，关闭紫外灯，打开风机清洁空气出去臭氧;

5、点燃酒精灯;取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮头;过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。

6、将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

7、倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去残留的就培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

8、每个大培养瓶加入1ml胰酶，小培养瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。

9、加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖好瓶盖，适度拧紧后稍回转，以利于CO2的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

10、对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。直接将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

五、注意事项

1、传代培养时注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。所有操作尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每种细胞使用一套器材。

2、每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

3、如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BBS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗生素，并经常更换培养基。

Ⅴ、细胞的冻存与复苏

一、 实验目的

掌握细胞保存的方法，能独立地进行细胞的冻存与复苏操作。

二、实验原理

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到保种的作用。此外，还可以利用细胞冻存的形式购买、寄赠、交换和运送某些细胞。

细胞冻存时向培养基中加入保护剂——终浓度5%-15% 的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，在细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

采用“慢冻快融”的方法能较好的保证细胞的存活。标准冷冻速度为-1~-2℃/min，当温度低于-25℃时加速，到-80℃之后直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入40℃热水中迅速解冻。

三、仪器、试剂和材料

仪器：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、微量加样器、水浴锅、离心机。

材料：冻存管、细胞培养用材料、500ml烧杯、胶布、搪瓷杯、75%酒精棉球。

试剂：培养基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亚砜(DMSO)或甘油、0.5%台盼篮染液、液氮。

四、实验步骤

(一)细胞冻存

1、取待冻存的细胞用胰酶消化，用培养基将细胞冲洗下来。800r/min离心5min，弃上清收集细胞。如果是悬浮培养的细胞，可直接离心收集细胞。

2、加入适量冻存液(10%甘油+90%培养基，或是10%DMSO+90%培养基)制成细胞悬液。细胞浓度宜大，undefined106个/ml左右，并可适量增加小牛血清浓度至20%。

3、细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记(注明细胞种类、时间、条件等)。

4、冻存管在4℃下存放30min，转放-20℃1.5h~2h，再转入-70℃4~12h后即可转入液氮内(-196℃)，注意进行登记。

(二)细胞复苏

1、取一搪瓷杯盛上适量自来水加热至40℃左右。

2、从液氮中取出冻存管立即投入40℃水中迅速解冻。

3、取出冻存管，用75%酒精清洁管口，打开。

4、离心去上清收集细胞，用无血清培养基洗1次，加入3ml新鲜培养基，于小培养瓶中培养。

5、每日观察细胞生长情况，如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长满后进行传代培养。

五、注意事项

1、在使用含有DMSO的冻存液时，因为DMSO在室温状态易损伤细胞，所以在细胞加入冻存液后应尽快放入4℃环境中。

2、准确记录细胞的种类、冻存时间、冻存液的品种和冻存者信息。

小结：这里总结了动物细胞培养的从器材消毒、试剂配制、细胞的冻存复苏操作技术，希望对大家有用