动物细胞培养中Hanks液、D-Hanks液和消化液的配制方法

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Hanks液可以维系细胞正常渗透压与pH，本文主要记录了动物细胞培养 中Hanks液、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制方法及其注意事项。

动物细胞培养: Hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制

实验目的： 熟练掌握Hanks、D-Hanks液等平衡盐溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。

实验原理：Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。 胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养 时用于处理组织块，使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。本实验室一般用1：250(GRC公司生产)。胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说浓度大、温度高(勿高于37℃)、作用时间长，则对细胞分离能力大。但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力最强。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。 细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%或0.2%。用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%。

实验材料与用品：

~undefined*材料：3 000 mL锥形瓶，25 mL、50 mL试剂瓶，500 mL输液瓶，螺口盖，翻帽塞，pH试纸，孔径0.22μm的微孔滤膜。

~undefined*药品：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚红，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA ，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚红(0.1%)(配法：称酚红2 g，置于研磨器中，先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加进该5.6%NaHC03溶液使最终体积为100 mL。瓶装保存，备用)。

~undefined*仪器(请参看仪器图库)： 抽滤泵1套，过滤器1套，高压灭菌锅，量筒，磁力搅拌器，研磨器。

实验步骤：

(一)配制D-Hanks液

1.按表2—3—5称取D-Hanks试剂。

2.依次加入上述试剂至800 mL蒸馏水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高压灭菌，10磅10 min。

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(二)配制Hanks液

1.按表2—3—5称取Hanks试剂。

2.配制Hanks时，需将CaCl2另溶解于100 mL的蒸馏水中。

3.依次加入上述试剂至700 mL蒸溜水中，溶解后再与CaCl2溶液一起定容至1 000 mL。

4.10磅，10 min高压灭菌。

(三)配制胰蛋白酶消化液

1.D.Hanks液高压灭菌之后，晾至室温，4℃保存备用。

2.称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天时研磨器应放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，调制成糊状。再放入4℃预冷的适量D-Hanks液中，4℃下磁力搅拌使完全溶解。

3.用NaHC03干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右(胰酶作用的最适pH值)，并加入0.02%EDTA以协助消化作用。

4.滤过除菌(方法见二、培养基的配制)，-20℃冻存。

注意事项：

1.BSS的pH值应确定为7.2左右。

2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混，则可将100 mL的CaCl2与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后，再在无菌条件下配制，定容。这样可以避免高压灭菌后液体变混。

3.胰酶受热易失活，所以尽量避免盛夏配制，并且在配制过程中温度应始终保持在4℃左右。

4.胰酶研磨要充分，否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉，不能达到真正的浓度。

5.胰酶分装时尽量分装成多瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时体积会膨胀，而多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并可能造成污染。

D-hanks液和hanks液间区别是hanks液中含有MgCl2 、MgSO4 、CaCl2和葡萄糖，而D-hanks中不含有这些，D-hanks液主要用于消化液等，Ca/Mg离子可以降低消化液中胰蛋白酶的活性，严重影响消化的效果。所以只有D-hanks液用于消化液