液相芯片技术研究应用进展

人类基因组计划(HGP)的完成和蛋白质组计划(HPP)的启动，获得了数量巨大的基因和蛋白质信息，而要对如此庞大的信息进行全面的处理和研究，必须设计和利用更为高效的硬件和软件技术，建立新型、高效、快速的检测分析方法。生物芯片正是在这种背景下应运而生，其不仅在高通量基因测序、基因表达研究、蛋白质相互作用等方面发挥重要作用，亦将在临床诊断中占据重要地位[1]。液相芯片(1iquichip)是美国纳斯达克上市的Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，它既能为后基因组时代科学研究提供强大的技术支持，又能提供高通量的新一代分子诊断技术平台。现就液相芯片的基本技术原理、制备方法、与传统固相芯片比较的优越性及其初步临床应用进行综述。

一、液相芯片的的基本技术原理

液相芯片的技术原理并不完全等同于传统意义上的固相生物芯片。所谓生物芯片是通过微加工技术将大量可寻址的生物识别分子如核酸片段、多肽分子甚至细胞、组织片断等按照预先设置的排列方式固定在厘米见方的芯片片基上，使芯片上每个坐标点就代表一个探针分子，利用生物分子之间的特异性亲和反应，实现对基因、配体、抗原等生物活性物质的检测分析，相应的有基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等分类。

它是分子生物学和IT行业成功融合的结果，采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念，因此可同时分析成千上万种生物分子。具有高通量、高灵敏度和并行检测的特点。但值得注意的是信息量大并不等于质量高。实际上，生物芯片的一个突出弱点就是其信息质量的稳定性和可重复性比较差。且无法实现定量检测[2]。而在临床实际应用中，某一生物学指标单纯的阴性或阳性并不能确切说明问题，需超过某一固定阈值方有诊断价值。正因为这个缺陷，芯片的临床应用受到较大限制。

液相芯片技术是新近开发出的既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子诊断技术平台。液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相芯片系统。利用这个系统，我们可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析。由于分子杂交是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，其设计理念亦同样体现了计算机芯片的并行处理和高密度集成、高通量的精髓，所以冠以”液相芯片”之称，又称多功能悬浮点阵(MASA)[3]。

二、液相芯片的制备和检测

1、彩色微球的制作和探针分子的固定：液相芯片的核心技术是把微小的乳胶颗粒亦称微球(beadormicrosphere)分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的寡核苷酸或蛋白质探针以共价方式吸附到不同颜色的微球上。乳胶颗粒是由聚苯乙烯制成的大小均一的圆形微球(直径约5.6um)，在其制作过程中按照严格的精确比例掺入了两种不同的红色分类荧光染料，每种染料各有10种区分，因而根据其搭配比例不同可以把球型基质分为100种，使得每个微球都获得了其特定的光谱地址。且此光谱地址是由两种红色荧光染料的相对掺入比例唯一决定。

利用这100种球形基质，可以标记上100种不同的探针分子，从而对一个样本中的100种不同的目的分子同时进行检测。此种设计理念亦是液相芯片与传统生物芯片相比较的最大不同之处：即传统生物芯片依靠其承载基片上的坐标定位进行寻址，而液相芯片则是根据微球颜色进行区分。为了便于探针分子的连接固定，微球表面常需要进行一系列的碳氧化学修饰和预处理[4]。

2、相悬浮反应：由于微球表面既可以包被蛋白质抗体亦可以加上核酸探针，因而液相芯片既可以用来诊断蛋白质变化亦可以分析核酸丰度，应用面非常广泛。使用时，先把针对不同检测物的不同颜色的乳胶颗粒混合。再加入被检测物。在悬液中乳胶颗粒与待测标本特异性地结合，并加上荧光标记。

由于多种颜色的乳胶颗粒可以放在同一个反应体系内，所以患者的一小份标本可以被用来同时检测上百个生理或病理指标，标本利用率高；杂交是在悬浮的液相中进行，因而反应时间短，杂交后常不用洗涤就可以直接读数，操作简单；检测效率亦大大高于固相沉底杂交，且液相也给蛋白质的检测提供了一个相对稳定的环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，有利于探针和被检测物的反应[5]。

在液相基因芯片中，待测核酸可在聚合酶链反应(PCR)扩增中直接加上荧光标记。而在液相蛋白质芯片中，若被检测分子为抗原，由于探针分子和报告分子作为抗体而言都应能与待测抗原特异性结合，且两者应分别结合于不同的抗原表位，故待测抗原应为具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子抗原的检测。此点与酶联免疫吸附实验(ELISA)相似，但尤应引起注意的是一些商业化的抗体对适用于ELISA可能并不适用于液相芯片。这可能与微球共价吸附时改变了抗体构型有关[6]。若被检测分子为抗体，则操作相对简单。因为抗体本身即具有Fab和Fc段。可采用IgG免疫不同种属的动物获得的二抗作为报告分子。

3、反应结果的检测：乳胶颗粒被微量液体传送系统排成单列通过两束激光：一束判定颗粒的颜色从而决定被测物的性质(定性)，另一束测定微粒上的荧光标记强度从而决定被测物的量(定量)。所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果，其实验流程类似流式细胞仪。两束激光分别分析乳胶颗粒上荧光颜色(特异性)和杂交信号(敏感性)，而且激光只分析颗粒一定半径内的信息，所以检测特异性强，信噪比高，背景低[7]。

三、液相芯片的初步临床应用

1、液相基因芯片：液相基因芯片即将预先人工合成的寡核苷酸探针共价连接于微球表面构成。Luminex公司建议最佳捕获探针长度为18～20bp，特殊情况下为获得更大的荧光信号，可适当延长至22～24bp[8]。液相基因芯片除具有一般的固相基因芯片或称寡核苷酸微阵列的功能，如核苷酸测序、单核苷酸多态性分析、基因作图等[9]，还体现了精确的同时定性、定量分析特征。

2、液相蛋白质芯片：(1)抗体含量的定量分析：国外学者通过将病原体的表面和(或)核心抗原或变态反应原固定在微球表面(每个微球可提供1～2×10共价吸附表位，因而每个微球表面不是单个而是密布捕获分子)，从而实现对多种传染性疾病如系统性念珠病、麻疹、单纯疱疹、流行性腮腺炎和变态反应性疾病的快速诊断[lO-12]。Faucher等[13]应用相同原理，将HIV一1的7种表面和核心抗原(p-17、24、55、66、gP一41、120、160)共价连接于微球表面，制备了HIV-1感染的液相芯片试剂盒，并与传统的免疫印记Westernblot方法进行比较，显示出更高的敏感性和特异性。(2)激素水平的测定：Bellisario等[14]利用液相芯片技术同时测定新生儿血清促甲状腺素(TsH)和甲状腺素(T4)水平以早期诊断先天性甲减，取得良好效果。Lukacs等[15]在此基础上引用竞争性抑制方法，省略了共孵育期间的一系列漂洗步骤，而且该系统不仅适用于新鲜血清，亦适用于干燥血斑，显示了其极强的通用性。同时，国外学者正积极开发可同时检测如17-羟孕酮、苯丙氨酸羟化酶等多种内分泌代谢产物或关键酶的试剂盒，以达到一次抽血即可完成对先天性肾上腺皮质增生、苯丙酮尿症等多种先天性疾病诊断的目的。(3)细胞因子的检测：amok等[16]设计了包括6种促炎性细胞因子(IL-1B、6、8、10、12、TNF—a)的液相芯片检测系统以早期诊断新生儿脓毒血症，并与传统的ELISA法进行了对比。

检测结果显示无论在敏感性还是特异性上液相芯片均显著优于ELISA，并体现了下列优点：

(1)样本需求量小：ELISA每次实验均至少需要100～2001外周血，而采用液相芯片只需50血液即可在一支试管中完成所有检测项目，总体可节约80％以上的样本，这对外周血极难提取的早产新生儿尤有意义；

(2)操作流程简化：由于ELISA工作曲线的置信区间仅2～3对数级。因而对于较高浓度的细胞因子的检测，其样本必须经不同程度的稀释以满足实验精确度，而液相芯片采用荧光分析。其置信区间可达4～5对数级，活性范围可10倍于ELISA，从而省略了繁琐的稀释和洗涤步骤；

(3)高效性：液相悬浮状态下更有利于蛋白质问的空间结合．其结合效率大大高于ELIsA固相沉底。

四、展望

目前液相芯片技术成熟，已有商业化的彩色微球及配套的检测系统销售，实验者不必再做大量投资用于前期研发。使用者既可以接受实验室已有的实验方案，亦可以自行设计分析方案或使用成套试剂盒，应用面非常广泛。其高通量、高精确性的特点亦符合临床所需的多指标联合检测的思路。可以预见，液相芯片作为生物信息学先进的操作技术平台，必将有着更广阔的应用前景。

五、参考文献

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