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植物根系活力的测定(TTC法)

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实验原理

氯化三苯基四氮唑(TTC)是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素,溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲瓒,生成的三苯甲瓒比较稳定,不会被空气中的氧自动氧化,所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体,植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原,可因加入琥珀酸,延胡索酸,苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。

实验试剂

1.乙酸乙酯(分析纯)。

2. 次硫酸钠(Na2 S2 O4 ),分析纯,粉末。

3. 1%TTC溶液 准确称取TTC1.0g,溶于少量水中,定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。

4. 磷酸缓冲液(1/15mol/L,pH7)。

5. 1mol/L硫酸 用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml,边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000ml。

6. 0.4mol/L琥珀酸 称取琥珀酸4.72g,溶于水中,定容至100ml即成。

实验设备

1. 分光光度计;2. 分析天平(感量0.1mg);3. 电子顶载天平(感量0.1g);4. 温箱;5. 研钵;6. 三角瓶50ml;7. 漏斗;8. 量筒100ml;9. 吸量管10ml;10. 刻度试管10ml;11. 试管架;12. 容量瓶10ml;13. 药勺;14. 石英砂适量;15. 烧杯10ml、1000ml。

实验材料

水培小麦根系。

实验步骤

1. 定性测定

1)配制反应液把 1% TTC 溶液、 0.4 mol/L 的琥珀酸和磷酸缓冲液按 1:5:4 比例混合。

2)把根仔细洗净,把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中,倒入反应液,以浸没根为度,置 37℃左右暗处放 1~3h ,以观察着色情况,新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色,表明该处有脱氢酶存在。

2. 定量测定

1)TTC标准曲线的制作

取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中,加少许Na2 S2 O4 粉摇匀后立即产生红色的甲攒。再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含甲攒25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列,以空白作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线。

2)称取根尖样品0.5g,放入10ml烧杯中,加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml,把根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1~3h,此后加入1mol/L硫酸2ml,以停止反应。(与此同时做一空白实验,先加硫酸与根样品,10分钟以后再加其他药品,操作同上)。

3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎,以提出甲攒。红色提取液移入试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次,皆移入试管,最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色,以空白试验作参比测出吸光度,查标准曲线,即可求出四氮唑还原量。

3. 结果计算

四氮唑还原强度(mg/g(根鲜重)/h)=四氮唑还原量(mg)/[根重(g)×时间(h)

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